Isolamento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de humanos congelados gastrointestinais Amostras
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) têm vindo a ganhar cada vez mais atenção para o seu papel na patogênese e suas contribuições para ambos cicatrização de feridas e promoção do microambiente do tumor. Embora não existam actualmente muitas técnicas para o isolamento de CM (GI) de tecidos gastrointestinais, este protocolo introduz um novo elemento de isolamento destas células estromais de tecido congelado. Congelamento amostras de tecido GI não só permite que o pesquisador para adquirir amostras de colaboradores em todo o mundo, biobancos, e vendedores comerciais, ele também permite o tratamento tardio de amostras frescas. O protocolo descrito consistentemente produzir células fusiformes característicos com o fenótipo MF que expressam os marcadores CD90, α-SMA e vimentina. À medida que estas células são derivadas a partir de amostras de doentes, a utilização de células primárias também confere a vantagem de que imitam de perto MFs de estados de doença, ou seja o cancro e doenças inflamatórias do intestino. Esta técnica tem a abelhan validado em gástrica, intestino delgado e do cólon MF geração cultura primária. MF culturas primárias podem ser utilizados em uma vasta gama de ensaios ao longo de um número de passagem e a sua pureza avaliada por ambos imunocitoquímica e análise de citometria de fluxo.
Introduction
Miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representam uma população abundante de células em gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromais estão localizados logo abaixo do epitélio e formar uma rede interligada dentro da lâmina própria da mucosa no intestino. MFs não são apenas responsáveis pela deposição da matriz extracelular, mas através da regulação parácrina podem influenciar o transporte de electrólito, restituição e a função de barreira do epitélio adjacente 1, 2. Além disso, CM ter sido mostrado desempenhar um papel chave na inflamação e tecidos remodelação 3, 4. Miofibroblastos são uma parte crítica do microambiente do tumor, onde também são conhecidas como fibroblastos associados ao câncer, e contribuir para o crescimento de células tumorais e servir como um nicho de células-tronco do câncer 3. Dados emergentes sugerem que os CM também pode servir como células apresentadoras de antígenos locais. Além disso, a função MFs como reguladores importantes de respostas imune inata e adaptativa, producing uma variedade de citocinas e factores de crescimento 5.
Em indivíduos saudáveis, as células MFS são acreditados para diferenciar a partir de células-tronco mesenquimais e expressam na sua superfície celular, o marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células também são positivas para vimentina, mas negativo para epitelial e marcador de células hematopoiéticas, EpCAM e CD45 , respectivamente. Os miofibroblastos são sugeridos como sendo uma forma activada de fibroblastos e podem ser distinguidas a partir de fibroblastos não-activado pela expressão de α-SMA 5.
Ao longo da última década, várias abordagens para o isolamento de miofibroblastos da mucosa do cólon humano foram publicadas-principalmente com base no método originalmente descrito por Mahida et al. 5-8. Enquanto os estudos individuais relatar os procedimentos de isolamento a partir de vários mucosa intestinal, nenhum protocolo universal para o isolamento de CM a partir de várias áreas do tracto GI (por exemplo, úlcera gástrica, pequena e Lmucosa intestinal arge) foi publicada. O protocolo aqui apresentado foi testado e utilizado com êxito para todos os três tipos de tecido acima mencionados. . Além disso, não foram relatados os procedimentos para isolar MFs de mucosa GI congelados.
Aqui, apresenta-se um método aperfeiçoado, que se baseia na digestão enzimática, e ao mesmo tempo permite o isolamento da mucosa do intestino humano MFs para cultura e análise de citometria de fluxo em recém-digeridos, unicelulares, preparações mucosas. Esta técnica produz culturas primárias de forma fiável com um fenótipo MF. Além disso, os mesmos métodos podem ser utilizados para isolar MFs de amostras congeladas de tecidos intestinais gástricas e pequenas bem. Isolamento de miofibroblastos de tecido GI fresco foi previamente descrito; No entanto, a utilização de amostras congeladas apresenta muitas vantagens. Ou seja, os pesquisadores seriam capazes de coletar e armazenar tecidos de qualquer número de colaboradores em todo o mundo que têm a capabilidade para enviar amostras de tecidos congelados. Além disso, os pesquisadores podem encontrar a coleção de tecido descartado da sala de cirurgia e / ou do conjunto de endoscopia e imediato processamento do tecido para o isolamento de conflito com a sua programação experimentação atual. Além disso, devido à natureza imprevisível da cirurgia, recolha de tecidos pode ocorrer muito tarde no dia, o que irá limitar o tempo que resta para o tecido processamento. Congelamento de tecido para posterior processamento irá melhorar esses desafios.
Por fim, estes métodos têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miofibroblastos intestinais do cólon, gástrico e pequenas em estados de doença tais como carcinoma colorrectal e doenças inflamatórias do intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora este protocolo foi desenvolvido para a aplicação de investigação única, à luz da cada vez maior importância crítica de células estromais como um cancro de biomarcadores potenciais prognósticos e alvo terapêutico, a capacidade de congelar biospecimens "funcionais" para uso posterior oferece uma vantagem significativa. Isto representa uma vantagem única para a criação de biorrepositório clínico, que pode servir como ferramentas adicionais servindo para fazer avançar o desenvolvimento da m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
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