호흡기 유체의 Equid 헤르페스 바이러스-2 진단에 대한 정량적 PCR 방법의 개발 및 검증

참고 : 그림 1에 예시하는 여러가지 단계를 참조하십시오. 1. 핵산 추출 참고 핵산과기도 오염을 제한하는 흄 후드 추출을 수행한다. 시약 중 어느 것도 원하지 않는 DNA로 오염되지 않도록하기 위해 DEPC 처리 된 물을 추출 음성 대조군을 포함합니다. 이전에 설명 프로토콜 (15)와 제조 업체의 프로토콜에 따라 생물학적 시료로부터 핵산을 추출합니다. 분해 용액 (AVL 버퍼) 560 μL를 생물학적 시료 140 ㎕를 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. 에탄올 560 μl를 추가합니다. 실리카 칼럼과 원심 분리기에이 솔루션 (샘플 + 용해 액 + 에탄올)의 첫 번째 630 μl를 적용합니다. 같은 실리카 컬럼 및 원심 분리기에이 솔루션의 나머지 630 μl를 적용합니다. 500 μL와 열을 씻어2 개의 다른 세척 버퍼 (AW1 및 AW2)의. 용출 완충액 (AVE 버퍼) 50 μL로 핵산을 용출하고, 실온으로 평형화. 마개를 닫고 1 분 동안 실온에서 배양한다. 1 분 동안 6,000g에서 원심 분리기. 2. 증폭 절차 각 반응에 대한 반응 혼합물의 22.5 μl를 준비합니다. PCR 마스터 믹스, X μl를 20 μM 정방향 프라이머의, X μl를 20 μM 역방향 프라이머, 22.5 μl를 도달하기 위해 필요한 초순수 ㎕를 10 μM 프로브 및 z의 Y μL의 12.5 μl를 추가합니다 (X는 Y 및 Z 볼륨을 얻을 수있다 적정 후, 섹션 3.2.3과 3.2.6)를 참조하십시오. 분취 웰 96- 웰 플레이트의 각 반응에 대한 적절한 반응 혼합물 22.5 μL. 참고 : 추출에 대한 부정적인 컨트롤을 포함하고 PCR의 시약의 누구도 원하지 않는 DNA로 오염되지 않습니다 보장하기 위해. 샘플의 2.5 μL, 추출 negativ의 2.5 μl를 추가전자 제어, PCR 음성 대조군의 2.5 μl를 잘 대응하는 반응에 긍정적 인 샘플 (참조 변형 또는 플라스미드)의 2.5 μL. 배포 후, 접착제 플레이트 씰 플레이트를 커버한다. 6,000g에서 10 초 동안 접시를 원심 분리기. 실시간 PCR 시스템의 플레이트를 놓습니다. 분석 레이아웃 템플릿을 선택하고 실행을 시작합니다. 95 ° C에서 15 초 45주기 다음 95 ° C에서 10 분, 60 ° C (표 1)에서 1 분 다음 PCR 프로그램 설정을 사용합니다. 스프레드 시트 실시간 PCR 시스템에서 원시 데이터를 전송. 기준선 위의 증폭 플롯 임계 값을 설정하고, 지수 성장 영역 내에서 각각의 샘플에 대한 임계주기를 얻었다. 선형성을 얻기위한 표준 곡선으로 설정된 각 점 표준 플롯. 표준 곡선에 기초하여, 상이한 샘플 카피 수를 계산한다. 정량적 RT-PCR 3. 개발 주 : QRT-PCR 시험의 개발 기준 균주 특정 적정 플라스미드와 상이한 제어가 필요하며, 프라이머 및 프로브의 적정을 수반한다. 예비 시험 이전의 추천 (16)에 따라 특정 소프트웨어와 디자인 프라이머 및 프로브. 섹션 1과 참조 균주의 압축을 풉니 다. 프라이머를 최종 농도 900 nM의 프로브의 최종 농도는 250nm로 (2)에 기재된 바와 같이 증폭한다. 2.5 절에 설명 된 신호를 분석한다. 프로브없이 (3.1.3 절에서 설명한 바와 같이) 동시에, 기준 균주 DNA의 증폭을 수행한다. 상거 법 (17, 18)에 의해 얻어진 증폭 시퀀스. 염기 BLAST (19)을 실행하여 서열을 분석 할 수 있습니다. 프라이머 및 프로브의 적정 프로브 250 nM의 최종 농도가 다른 최종 CONCENTR로 3 가지 믹스를 준비순방향의 관리 포인트 및 포지티브 샘플과 대조군의 3 회 반복 역방향 프라이머 (50 ㎚ / 50 nM 내지 300 ㎚ / 300 nM 내지 900 ㎚ / 900 ㎚). 각 믹스 (900 nM의 최종 농도를 얻기 위해 300 nM의 최종 농도 4.5 μl를 얻기 위해, 50 nM의 최종 농도를 얻기 위해 0.25 μL 1.5 μL)를 20 μM 정방향 프라이머 같은 적절한 부피 및 20 μM 역방향 프라이머를 추가 , PCR 마스터 믹스를 50 ㎕의 필요에 따라 10 μM 프로브와 초순수 2.5 μl를 90 μl를 달성한다. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행한다. 증폭의 최고 수준을 얻기 위해 가장 좋은 조건을 선택, 빠른 사이클 임계 값 (CT)과 3 조건 사이의 최적의 반복. 최고 농도와 앞으로의 μL 해당 볼륨 X를 결정하고 프라이머를 역방향. 4 샘플 5 가지 믹스 (포지티브 샘플 3 회 반복하고, 음성 대조군)를 준비프로브의 5 가지 최종 농도 (50 nM의, 100 nm의, 150 nm의, 200 nm의, 250 nm의)와 함께. 각 조합의 경우를 얻기 위해 0.5 μL, (섹션 3.2.3에서, 이전에 결정된) 20 μM 정방향 프라이머와 X ㎕를 20 μM 역방향 프라이머의 μL PCR 마스터 믹스 50 μL, 10 μM 프로브의 적절한 볼륨을 (추가 x 90 μl를 달성하기 위해 필요한 50 nM의 농도, 1 μL가 250 nM의 농도) 및 초순수를 얻기 위하여, 150 nM의 농도를 얻기 위하여, 200 nM의 농도를 얻기 위해 2 μL 2.5 μl를 1.5 μL을 100 nM의 농도를 얻었다. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행한다. 증폭의 최고 수준을 얻기 위해 가장 좋은 조건을 선택, 빠른 사이클 임계 값 (CT)과 5 조건 사이의 최적의 반복. 최고 농도와 프로브에 해당하는 볼륨 y를 μl를 결정합니다. 양이 정말이에요 4. 특성1- 시간 PCR (QRT-PCR) 주 : 최상의 상태의 발달 단계 및 결정이 사용 후 PCR의 특성화 단계는 특이 검출 한계, 선형성 범위 QRT-PCR의 정량 한계를 포함한다. 준비 및 플라스미드의 적정 PCR을 위해 선택된 DNA 표적 유전자의 관련 단편 함유 상용 플라스미드 예약 (이 프로토콜을 뉴클레오타이드 EHV-2 B 당 단백질 유전자의 2081년부터 2381년까지은 표 1 참조). 합성 DNA와기도 오염의 위험을 제한하기 위해 개발 및 검증 절차의 모든 단계에서 별도의 방에서 흄 후드에서 플라스미드의 연속 희석을 수행하고 희석 DNA 작업 :합니다. 다시 50 ng를 정지 / ㎖에서 원액을 제조 초순수 플라스미드. 간단히 소용돌이와 원심 분리기 플라스미드 주식 솔루션. 참고 : 플라스미드 석재의 실제 농도를 결정플라스미드의 카피 수를 계산하기 위해 다시 현탁 후 CK 용액. 분광 광도계에 플라스미드의 1 μl를 추가합니다. 230 nm의, 260 nm의 280 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 참조하십시오. 분광 광도계 소프트웨어 (OD 260 ㎚)에 대한 DNA 농도를 읽으십시오. 아보가드로 수 (N A) 및 수식을 사용하여 플라스미드의 카피 수를 계산한다 : 복사 번호 / μL = (N A [NG에 플라스미드 / μL]) / (플라스미드 길이 기본 쌍 × 109 X 평균 무게) = (6022 × 10 23 X [플라스미드]) / (플라스미드 길이 × 109 X 660) QRT-PCR의 특이성 (포괄 성 및 독점)를 테스트 PCR을 시스템의 포괄 성을 테스트합니다. 선택 EHV-2 양성 DNA 샘플, 이전 순서에 의해 특징 (긍정적 인 상태를 설립). 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행한다. 분석각 샘플에 대한 PCR 데이터로 2.5 절에 설명. 섹션 4.2.1에서 선택한 모든 샘플에 대한 지수 곡선의 존재를 확인하고 PCR의 포괄 성을 확인합니다. 이 경우의 표적 유전자 유사성 병원체로부터 DNA를 추출하여 PCR 시스템의 독점 (시험 예 EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 및 전함 헤르페스 -5- 다른 equid 헤르페스는 바와 같이 표 2)이 경우 호스트의 호흡기 질환에 관여하는 다른 병원균 (에, 말 동맥염 바이러스, 말 인플루엔자 바이러스, Coxiella의 burnetii,로도 코커스 동등, 연쇄상 구균 동등 동등, 연쇄상 구균 동등 zooepidemicus, 한 Chlamydophila 보르 투스와 폐렴 간균, ) 표 2를 참조하십시오. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행한다. 섹션 2.5에 기재된 바와 같이 각각의 샘플에 대한 PCR 데이터를 분석한다. 모든 샘플의 선택에 대한 지수 곡선의 부재를 확인섹션 4.2.4은 PCR의 독점을 확인합니다. QRT-PCR 검출의 한계 6 튜브에 초순수의 90 μl를 분배. 저감 구역 (CT 감지 손실)을 대상으로 플라스미드의 6 10 배 연속 희석을 수행합니다. 전송 초순수 90 μL로 희석 튜브에 작동 플라스미드 10 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 4.3.2 플라스미드를 받았다. 제 2 항에 기재된 플라스미드 6 10 배 희석액의 증폭을 수행한다. 저감 영역 결정 : 긍정적 인 신호 검출이없는 최초의 희석을 제시 플라스미드의 마지막 희석 사이의 영역 (그림 2 참조). 6 두 배 연속 희석을 시작하려면 긍정적 인 신호를 (섹션 4.3.4 참조) 제공 플라스미드의 마지막 희석을 선택합니다. 참고 : 3 독립적 인 트라이를 수행ALS는 QRT-PCR (LOD는 95 % PCR)의 검출 한계를 결정 (6) 튜브에 초순수 25 μL 분주. 플라스미드의 6 두 배 연속 희석을 수행합니다. 전송 초순수 25 μL와 튜브 섹션 4.3.5에서 결정된 바와 플라스미드 작업 희석액 25 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 4.3.7은 플라스미드를 받았다. 절에 설명 된대로 2 반복 6 10 배 각각 8 회 반복 (24 회 반복)로 3 시험판을 얻었다 회 4.3.8 4.3.7하는 단계 플라스미드의 6 개의 배 희석액의 증폭을 수행 플라스미드의 연속 희석. 참고 QRT-PCR 검출 (LOD는 95 % PCR)의 제한의 경우 95 %에서 검출 볼륨 단위로 낮은 DNA 카피 수로서 정의된다. 플라스미드 집중하고 각 레벨에 대해 24 회 반복에서 긍​​정적 복제 수를 계산기. LOD를 95 % PCR을 결정합니다. LOD를 95 % PCR은 24 복제 중 23 개의 긍정적 인 복제의 검출 결과 수준이다. 직선 범위 및 QRT-PCR 정량의 한계 참고 : 범위에 사용 된 가장 낮은 농도가 PCR은 4.3.10 이전에 결정된 LOD 95 %에 해당하는 것을 보장하기 위해 플라스미드의 6 10 배 연속 희석하여 4 독립적 인 시험을 수행합니다. 6 튜브 초순수의 45 μl를 분배. 10 7 LOD 95 % PCR에 해당하는 플라스미드 작업 희석 농도와 6 10 배 연속 희석을 시작합니다. 플라스미드의 6 10 배 연속 희석을 수행합니다. 전송 초순수의 45 μL와 튜브에 플라스미드 작업 희석 (섹션 4.4.2에서 결정) 5 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 4.4.3 페이지를 받았다lasmid. 제 2 항에 기재된 플라스미드 6 10 배 희석액을 증폭. 절편 (그림 3)의 기울기와 b에 대한과 선형 회귀 Y = AX + B를 추적합니다. 표준 곡선의 기울기 (A)로부터 증폭 효율 (E)을 계산 식을 사용하여 (4.4.5 참조) : . 반복 4.4.1 세 번 4.4.6에 단계를 반복합니다. 주 : 증폭 효율은 각 사이클 이후 PCR 생성물의 증가량을 나타낸다. 이상적인 반응은 100 %에 가까운 효율에 도달한다. 실제로, E (%)은 75 %와 125 % 사이였다. 높은 E가 아닌 특정 제품 또는 일련의 희석에 피펫 오류의 증폭을 표시 할 수 있습니다. 또한 직렬 희석, 가난한 프라이머 디자인 또는 비 최적 반응 조건에서 피펫 오류를 표시 할 수 있습니다 낮은 E. (표 바이어스를 계산3). 바이어스의 절대 값이 임계 바이어스 값 (0.25 로그 10)보다 작은 각 플라스미드 레벨에 대해 확인한다. 평균 바이어스 각 플라스미드 레벨 (표 3) EHV-2 qPCR에 대한 선형 회귀의 성능을 평가하기 위해 (그림 4)의 선형성 불확실성 (U LINi)를 결정합니다. U LINi 계산 전 수준을 플라스미드 각각에 대해 결정된 선형성 불확실성이다 표준 편차 (SD'i)로부터 바이어스를 의미한다. 공식에 의해 주어진 결합 선형성 불확실성 (U LIN) EHV-2 qPCR에의를 결정합니다 : (일반 절대 바이어스 0.25 로그 10) 바이어스 수용 실험실에 의해 특정되고, 낮은 값 (로그 10 카피 수 측정 량) 0.5 로그 (10)의 최대 값 사이의 차이에 대응하는 참고. U LIN </sUB> 값은 다른 실험실에서 qPCR에의 성능을 비교하는 데 도움 수 있습니다. QRT-PCR (LOQ PCR)의 정량의 한계를 결정 LOQ PCR은 직선 범위 (표 3)에 사용되는 바이어스 0.25 로그 (10)와 가장 낮은 농도이다. 삼라만상 분석 방법 5. 특성 (DNA 추출에서 QRT-PCR 결과에) 참고 : 전체 방법의 특성은 호흡 샘플에서 DNA의 추출에서, 즉 QRT-PCR 데이터를 (취득하기 위해 필요한 모든 단계의 검증이다 (대상의 증폭 및 정량에 섹션 1)을 참조하십시오 (섹션 2 참조 )). PCR 반응의 카피 수와 식 생물학적 시료에서 카피 수에 존재하는 사이의 대응 관계를 수립 : . 그만큼 <img alt="5.1-2" src="/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg가"/>하면 PCR 반응의 플라스미드 카피 수는, PCR에 추가 된 샘플의 부피가 증폭 동안 혼합하고, 버퍼 AVE의 용적이 핵산을 용출하기 위해 사용되며 상기 추출 된 샘플의 부피이다. 삼라만상 분석 방법의 민감도와 특이도를 테스트 참고 : 알려진 EHV-2 개의 긍정적 인 (또는 네거티브) 샘플은이 절에서 사용된다. 타겟 (EHV-2) 양성 샘플을 분석하여 QRT-PCR 방법의 "민감도"테스트. 선택 EHV-2 양성 DNA 샘플, 이전에 특징 (긍정적 인 상태). 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기재된 핵산을 추출한다. 실제 긍정의 수 (양의 샘플을 결정이 RT-PCR) 및 위음성의 수 (알려진이 RT-PCR과 음 양의 샘플)와 긍정적한다. 음의 샘플을 분석하여 QRT-PCR 방법의 "특이성"테스트 선택 EHV-2 부정적인 DNA 샘플 (음의 상태). 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기재된 핵산을 추출한다. 실제 네거티브 (이 RT-PCR에 부정적인 것으로 알려진 부정적인 샘플) 및 오탐 (false positive) (이 RT-PCR에 긍정적 알려진 부정적인 샘플)의 수의 수를 결정합니다. 다음과 같이 "진단 민감도"(SE)와 "진단 특이도"전체 방법 (SP) (표 4) 계산 : 괜찮다 = 실제의 SP = 수를 실시간 탐지 번호 / (실제 긍정 + 위음성의 수) 실제 부정의 부정은 / (수S + 오탐 (false positive)) () 표 4를 참조하십시오. 라이너 및 가드너 관계 12,20의 수식 전체 방법의 민감도 및 특이성에 대한 95 % 신뢰 구간을 계산한다 : E는 추정 오차이고, θ는 셀레늄 (또는 SP) 및 N 분석 샘플의 수이다. 주의 : 샘플의 수가 적은 경우, 전체 방법의 민감도 및 특이성에 대한 95 % 신뢰 구간을 계산 AFNOR 규범 12에 따른 슈 테이블을 사용한다. 삼라만상 분석 방법의 특성에 대한 부정적인 자원 소재의 제조 주의 : 전체 방법 (LOD 방법 및 LOQ 방법)의 검출 및 정량 한계를 결정 자유로운 것으로 알려진 생물학적 샘플 플라스미드의 공지 농도를 추가하려면대상 (EHV-2이 경우)의. 이들 샘플은, 정량화 된 플라스미드와 함께, LOD 방법 및 LOQ 방법을 결정하는 긍정적 인 기준을 구성한다. 양의 기준을 구성하는 데 사용되는 생물학적 샘플에서 타겟의 부재 (EHV-2)를 확인한다. 다른 알려진 부정적인 생물학적 샘플을 선택합니다. 2 절에 설명 된대로 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기술 된 바와 같이 생물학적 시료의 압축을 풉니 다. 이러한 샘플에서 PCR 신호의 부재에 의한 대상의 부재를 확인합니다. 참고 : 5.4과 5.5 사이의 모든 단계를 같은 음의 자원 소재를 사용합니다. 음극 재료 자원 (전체 검증을 위해 필요한 부피) 15 ml의 수득 다른 네가티브 샘플 풀. 100 튜브에 부정적인 자원 소재의 135 μl를 분배. 4 ° C에서 튜브를 유지하거나 장기 저장을 위해 -80 ° C에서. LIMI삼라만상 분석 방법의 검출의 t 전체 방법의 저감 영역을 결정합니다. 6 튜브 초순수의 45 μl를 분배. 플라스미드의 6 10 배 연속 희석을 수행합니다. 트랜스퍼 (섹션 4.3.10에 의해 결정) 초순수 45 μL와 튜브 107 LOD는 95 %에 해당하는 PCR 플라스미드 작업 희석액 5 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 5.4.1.2 플라스미드를 받았다. (2)를 얻기 위해 부정적인 자원 소재의 135 μL 2 관에 플라스미드의 각 희석에서 전송 5 μL는 6 개의 긍정적 인 표준에 대한 복제합니다. 소용돌이 간단히 원심 분리기. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기술 된 바와 같이 6 개의 포지티브 표준을 2 회 반복 추출을 수행한다. 저감 영역을 결정 : 마지막 진한 사이의 영역을긍정적 인 신호와 아무런 신호를 보여줍니다 처음 농도를주는 플라스미드의 entration. 이 방법의 검출 (LOD 방법)의 제한이 독립적 인 시험에 의해 결정 참고 : 전체 방법 (LOD 방법)의 검출 한계를 결정하기 위해 2 독립적 인 시험을 수행합니다. 4 배 농축 긍정적 인 신호를 준 플라스미드의 마지막 농도 (섹션 5.4.1.5 참조)이다 플라스미드 작업 희석와 6 두 배 연속 희석을 시작합니다. (6) 튜브에 초순수 25 μL 분주. 플라스미드의 5 두 배 연속 희석을 수행합니다. 전송 초순수 25 μL와 튜브 (섹션 5.4.2.1에서 결정된 바와 같이) 플라스미드 작업 희석액 25 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 5.4.2.3 플라스미드를 받았다. plasmi의 각 희석에서 전송 5 μL음극 재료 자원의 135 ㎕를 4 개의 튜브 D는 5 포지티브 표준 4 회 반복을 얻었다. 간단히 소용돌이와 튜브를 원심 분리기. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기재된 바와 같이 5 개의 포지티브 표준 4 회 반복 추출을 수행한다. 반복 플라스미드 농도의 각 레벨 8 복제를 얻기 위해 한 번 5.4.2.5에 5.4.2.1 단계를 반복합니다. 플라스미드 농도의 각 레벨 8 복제 중 긍정적 인 복제의 수를 계산합니다. LOD 방법을 결정합니다. LOD 방법 (섹션 5.4.2.7에 설명 된대로) 8 8 복제 양성의에서 복제되는 마지막 레벨입니다. 삼라만상 분석 방법의 정량의 직선 범위 및 제한 전체 방법 (LOQ 방법)의 정량 한계를 결정하기 위해 생물학적으로 플라스미드 알려진 농도를 추가합니다알려진 샘플은 대상 (EHV-2이 경우)이 없어야합니다. 이 샘플들은 LOQ 방법을 결정하는 양의 기준을 구성한다. 6 튜브 초순수의 45 μl를 분배. 플라스미드의 6 10 배 연속 희석을 수행합니다. 전송 초순수 45 μL와 튜브 (섹션 5.4.2.8에서 결정된 바와 같이) 107 LOD 방법에 대응 플라스미드 작업 희석액 5 μL. 소용돌이와 원심 분리기 간단히 튜브. 직렬 희석의 마지막 튜브까지 단계를 반복 5.5.2 플라스미드를 받았다. 생물 자원 음극 재료 135 μL 2 튜브 플라스미드의 각 희석액 5 μL의 전송은 6 포지티브 기준이 복제를 얻었다. 소용돌이 간단히 원심 분리기. 절에 설명 된대로 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기술 된 바와 같이 6 개의 포지티브 표준을 2 회 반복 추출을 수행하여 2 반복 단계 5.5.15.5.4 세 번에. 평가 및 방법의 정량적 성능을 검증하기 위해 정확도 프로파일을 정의합니다. 실험실을위한 전체 방법의 수용 한계를 정의합니다. 이 프로토콜에서, 수용 한계는 LABéO에서 0.75 ±로 로그인 (10)를 정의 프랭크 Duncombe. 하나 재판 추적 제 1 선형 회귀 Y = AX + B (A의 기울기와 B는 절편) 코네티컷 값 중 하나를 복제 표준 곡선의 각 추정값에 대응. 이 제 1 선형 리그 레션과,이 제 검량선 사용 코네티컷 값의 복제에 대한 카피 수의 실험적인 값을 계산한다. 코네티컷에 값의 복제와 두번째 단계를 반복 5.5.5.2 제 2 선형 회귀를 수득하고 제 2 기준 곡선 사용 코네티컷 값의 초 복제에 대한 카피 수의 실험적인 값을 계산한다. <li> 두 번째와 세 번째 시험과 단계를 반복 5.5.5.2. NF U47-600-2 (12)에 따라 각 플라스미드 수준에 대한 정확성, 진위 및 정확성 한계를 계산합니다. 모든 기준점 (5.5.5.4)에 대한 정보를 컴파일하고 5.5.5.1에​​서 이전에 정의 된 수용 한계를 갖는 정확도 프로필과 함께 데이터의 진위를 생성하기 위해 스프레드 시트를 만들고 5.5에서 계산 된 하부 및 상부 정확성 한도 .5.4 (그림 5). 정량 한계 방법을 결정 : 5.5.5.5에서 계산 된 직선 범위에서 사용되는이 진위 0.75 로그 (10)와 표준 곡선의 가장 낮은 농도에 해당한다. 반복성과 재현성의 평가 주 : 표준 편차의 비율을 측정하고 복제 (변동 계수 CV = 또는 표준 편차의 평균을 사용하여 반복성 및 재현성을 확인 /평균). 한 애널리스트에 의해 전체 방법의 반복성 평가 : (이전에 예를 들어 PCR 시험) 3 별개의 바이러스 게놈로드 3 생물학적 샘플을 선택합니다. 제 2 항에 기재된 증폭 절차를 수행 부 (1)에 기재된 바와 같이 3 개의 샘플을 8 회 반복 추출 하였다. 평균과 각 샘플 수집 가능한, CT 값의 표준 편차를 계산한다. 화학식 CV = 표준 편차를 이용하여 인트라 분석 CV를 계산 / 의미한다. 3 분석가에 의해 전체 방법의 재현성을 평가 : (이전에 예를 들어 PCR 시험) 3 별개의 바이러스 게놈로드로 3 생물학적 샘플을 선택 (1 절에 설명 된대로) 5.6.2.1에서 선택한 3 샘플의 2 복제 압축을 풉니 다. 2 독립적 인 분석가 부 (2)를 반복에서 5.6.2.2 단계를 설명한대로 증폭 절차를 수행합니다. 평균과 표준 편차를 계산각 샘플 수집 가능한, CT 값. 화학식 CV = 표준 편차를 이용하여 간 분석 CV를 계산 / 의미한다.