Entwicklung und Validierung einer quantitativen PCR-Methode für Equiden Herpesvirus-2-Diagnose in Atem Flüssigkeiten

Hinweis: Siehe all die verschiedenen Schritte , die in 1 dargestellt sind. 1. Extraktion von Nukleinsäuren Hinweis: Führen Sie Extraktion unter einer Abzugshaube Atemwegs Kontamination mit Nukleinsäuren zu begrenzen. Umfassen eine Extraktions negative Kontrolle mit DEPC-behandeltem Wasser, um sicherzustellen, dass keines der Reagenzien mit unerwünschten DNA verunreinigt sind. Extrahieren von Nukleinsäuren aus der biologischen Probe nach einem zuvor beschriebenen Protokoll 15 und Protokoll des Herstellers. Hinzufügen 140 ul biologischen Probe auf 560 & mgr; l Lyselösung (AVL-Puffer) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Hinzufügen 560 ul Ethanol. Gelten die ersten 630 ul dieser Lösung (Probe + Lyselösung + Ethanol) auf einer Silica-Säule und zentrifugieren. Anwenden, um die verbleibenden 630 & mgr; l dieser Lösung wurden zu gleichen Silicasäule und zentrifugiert. Dann waschen Sie die Säule mit 500 ulvon 2 verschiedenen Waschpuffer (AW1 und AW2). Eluieren Nukleinsäure mit 50 & mgr; l Elutionspuffer (AVE-Puffer) und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Schließen Sie die Kappe und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifuge bei 6.000 g für 1 min. 2. Amplifikationsprozedur Bereiten 22,5 ul Reaktionsmischung für jede Reaktion. Hinzufügen, 12,5 & mgr; l PCR-Mastermix, x & mgr; l von 20 & mgr; M Vorwärtsprimer, x & mgr; l von 20 & mgr; M Rückwärts-Primer, y & mgr; l von 10 & mgr; M Sonde und z & mgr; l ultrareinem Wasser als 22,5 & mgr; l zu erreichen erforderlich (x, y und z Volumina erhalten nach der Titration, siehe die Abschnitte 3.2.3 und 3.2.6). Aliquot von 22,5 & mgr; l der geeigneten Reaktionsgemisch gut zu jeder Reaktion in einer 96-Well-Platte. Hinweis: Fügen negative Kontrollen für die Extraktion und für die PCR, um sicherzustellen, dass keines der Reagenzien mit unerwünschten DNA verunreinigt sind. Hinzufügen, 2,5 & mgr; l der Probe wurden 2,5 & mgr; l Extraktions negative-Steuerung, 2,5 ul der PCR-negative Kontrolle und 2,5 ul der positiven Probe (Referenzstamm oder Plasmid) in die entsprechende Reaktion gut. Nach der Verteilung, decken Sie die Platte mit einer Klebeplatte Dichtung. Zentrifugieren Sie die Platte für 10 Sekunden bei 6.000 g. Die Platte wird in einer Real-Time PCR-System. Wählen Sie die Vorlage für den Test-Layout und den Lauf starten. Verwenden Sie die PCR Programmeinstellung: 10 min bei 95 ° C , gefolgt von 45 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C (Tabelle 1). Übertragen Sie die Rohdaten von der Real-Time PCR-System in eine Tabelle. Stellen Sie die Schwelle in den Verstärkungsstücke oberhalb der Basislinie und in der exponentiellen Wachstumsregion des Schwellenzyklus für jede Probe zu erhalten. Zeichnen Sie jeden Punkt Standard als Standardkurve gesetzt Linearität zu erhalten. Berechnen der Kopienzahl für die unterschiedlichen Proben auf der Standardkurve berechnet. 3. Entwicklung der quantitativen RT-PCR Hinweis: Die Entwicklung eines qRT-PCR-Test erfordert Referenzstämme, eine spezifische titriert Plasmid und verschiedene Kontrollen und beinhaltet die Titration der Primer und Sonde. Vorversuch Design – Primer und Sonden mit spezieller Software nach den bisherigen Empfehlungen 16. Auszug Referenzstämme, wie in Kapitel 1 beschrieben. Amplify, wie in Abschnitt 2 mit 900 nM für die endgültige Konzentration von Primern und 250 nM für die endgültige Konzentration der Sonde beschrieben. Analysieren Sie das Signal als in Abschnitt 2.5 beschrieben. Zur gleichen Zeit, führen Amplifikation von DNA-Referenzstämme ohne Sonden (wie in Abschnitt 3.1.3 beschrieben). Sequenz , die die Amplifikate durch die Sanger – Methode 17,18 erhalten. Analysieren Sie die Sequenzen , die durch eine Nucleotid – BLAST 19 ausgeführt wird . Titration von Primern und Sonde Bereiten Sie drei verschiedene Mischungen mit 250 nM Endkonzentration von Sonde und mit unterschiedlichen endgültigen concentrtionen der Vorwärts- und Rückwärts-Primer (50 nM / 50 nM, 300 nM / 300 nM, 900 nM / 900 nM) für die 3 Replikate der positiven Probe und eine negative Kontrolle. Für jede Mischung, die gleiche entsprechende Volumen von 20 & mgr; M Vorwärtsprimer hinzufügen und 20 & mgr; M Reverse-Primer (0,25 & mgr; l der 50 nM Endkonzentration zu erhalten, 1,5 ul der 300 nM Endkonzentration oder 4,5 & mgr; l zu erhalten, die 900 nM Endkonzentration zu erhalten) , 50 & mgr; l PCR Master Mix, 2,5 ul 10 uM Sonde und Reinstwasser nach Bedarf 90 & mgr; l zu erreichen. Führen Sie die Amplifikationsverfahren, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Wählen Sie die beste Voraussetzung für die höchste Stufe der Verstärkung, früheste Zyklus Schwellenwert (Ct) und beste Wiederholbarkeit zwischen den drei Bedingungen zu erhalten. Bestimme die beste Konzentration und das entsprechende Volumen x ul der Vorwärts- und Rückwärts-Primern. Bereiten Sie 5 verschiedene Mischungen für die 4 Proben (3 Replikate der positiven Probe und eine Negativkontrolle)mit 5 verschiedenen Endkonzentrationen von Sonde (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Für jede Mischung, fügen x ul 20 uM Vorwärtsprimer und x ul 20 uM Reverse-Primer (vorher bestimmt, in Abschnitt 3.2.3), 50 & mgr; l PCR-Master-Mix, entsprechende Volumen von 10 & mgr; M-Sonde (0,5 ul der zu erhalten 50 nM Konzentration, 1 & mgr; l der 100 nM Konzentration zu erhalten, 1,5 ul der 150 nM Konzentration zu erhalten, 2 & mgr; l der 200 nM Konzentration oder 2,5 ul zu erhalten, die 250 nM Konzentration) und Reinstwasser zu erhalten, wie es erforderlich ist, 90 & mgr; l zu erreichen. Führen Sie die Amplifikationsverfahren, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Wählen Sie die beste Voraussetzung für die höchste Stufe der Verstärkung, früheste Zyklus Schwellenwert (Ct) und beste Wiederholbarkeit zwischen den fünf Bedingungen zu erhalten. Ermitteln Sie die beste Konzentration und das entsprechende Volumen y ul für die Sonde. 4. Charakterisierung von Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) Hinweis: Nach der Entwicklungsschritt und die Bestimmung der besten Bedingungen zu verwenden, wird die Charakterisierung Schritt der PCR die Spezifität umfasst, die Nachweisgrenze, die Linearitätsbereich und die Grenze der Quantifizierung der qRT-PCR. Herstellung und Titration von Plasmid Bestellen kommerziellen Plasmid , das das relevante Fragment der DNA – Zielgens für die PCR ausgewählt , die (in diesem Protokoll, Nukleotide 2081 bis 2381 von EHV-2 – Glykoprotein B – Gen, siehe Tabelle 1). Hinweis: Um das Risiko von Atemwegs Kontamination mit synthetischen DNA begrenzen, führen Reihenverdünnungen von Plasmiden unter einer Abzugshaube in einem separaten Raum und arbeiten mit verdünnter DNA während aller Schritte der Entwicklung und Validierungsverfahren. Re-suspend das Plasmid mit Reinstwasser, um eine Stammlösung bei 50 ng / ml herzustellen. Vortex und Zentrifuge kurz die Plasmid-Stammlösung. Hinweis: Bestimmen Sie die wirkliche Konzentration des Plasmid stock Lösung nach Resuspension, um die Kopienzahl des Plasmids zu berechnen. 1 & mgr; l Plasmid zu dem Spektrophotometer. Lesen Sie die optische Dichte (OD) bei 230 nm, 260 nm und 280 nm. Lesen Sie die DNA-Konzentration auf dem Spektralphotometer Software (OD 260 nm) aus. Berechnen Sie die Kopienzahl des Plasmids unter Verwendung von Avogadro-Zahl (N A) und die Formel: Die Kopienzahl / ul = (N A [Plasmid in ng / ul]) / (Plasmid Länge x 10 9 x durchschnittliche Gewicht eines Basenpaar) = (6,022 x 10 23 x [Plasmid]) / (Plasmid Länge x 10 9 x 660) Testen der Spezifität (Inklusivität und Exklusivität) von qRT-PCR Testen Sie die Inklusivität des PCR-System. Wählen Sie EHV-2 positive DNA-Proben, die zuvor durch Sequenzierung charakterisiert (positive Status festgestellt). Führen Sie die Amplifikationsverfahren, wie in Abschnitt 2 beschrieben. analysieren Sie diePCR-Daten für jede Probe, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben. Prüfen Sie das Vorhandensein einer exponentiellen Kurve für alle in Abschnitt ausgewählten Proben 4.2.1 und bestätigen Inklusivität von PCR. Testen der Exklusivität des PCR-System unter Verwendung von DNA-Extrakten aus Pathogenen mit genetischen Ähnlichkeiten zu dem Ziel (in diesem Fall andere equid Herpesviren, wie EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 und asinine herpesvirus-5 beschrieben in Tabelle 2) und andere in respiratorischen Erkrankungen des Wirts beteiligt Pathogene (in diesem Fall equine Arteritis – Virus, Pferde – Influenza – Virus, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus und Klebsiella pneumoniae, siehe Tabelle 2). Führen Sie die Amplifikationsverfahren, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Analysieren Sie die PCR-Daten für jede Probe, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben. Überprüfen Sie, ob das Fehlen einer exponentiellen Kurve für alle Proben gewählt inAbschnitt 4.2.4 die Exklusivität der PCR zu bestätigen. Nachweisgrenze von qRT-PCR Dispense 90 & mgr; l von Reinstwasser in 6 Röhrchen. Führen 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids die Minderungszone (Verlust von Ct detection) zu zielen. Transfer 10 ul aus dem Plasmid in das Röhrchen mit 90 & mgr; l Reinstwasser Arbeitsverdünnung. Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 4.3.2 bis zur letzten Rohr in der Verdünnungsreihe wurde das Plasmid erhalten. Führen Sie die Verstärkung der 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids, wie in Kapitel 2 beschrieben. Bestimmen Sie die Minderungszone: die Zone zwischen der letzten Verdünnung von Plasmid , das ein positives Signal und die erste Verdünnung ohne Nachweis präsentiert (siehe Abbildung 2). Um die 6 zweifachen Reihenverdünnungen starten, wählen Sie die letzte Verdünnung von Plasmid, das ein positives Signal gibt (siehe Abschnitt 4.3.4). Hinweis: Führen Sie 3 unabhängige trials die Nachweisgrenze von qRT-PCR (LOD 95% PCR) zu bestimmen , Dispense 25 ul Reinstwasser in 6 Röhrchen. Führen Sie 6 zweifache serielle Verdünnungen des Plasmids. Transfer 25 ul aus dem Plasmid Arbeitsverdünnung, wie 4.3.5, in das Röhrchen mit 25 ul Reinstwasser in Abschnitt bestimmt. Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 4.3.7 bis zur letzten Rohr in der Verdünnungsreihe wurde das Plasmid erhalten. Führen die Verstärkung der 6 zweifachen seriellen Verdünnungen des Plasmids, wie in Kapitel 2. Wiederholen 4.3.7 Schritte zweimal 4.3.8, zu erhalten, 3 Versuche mit 8 Replikaten (24 Replikaten) von jedem der 6 Zehnfache Reihenverdünnungen des Plasmids. Anmerkung: Die Nachweisgrenze der qRT-PCR (LOD 95% PCR) als die niedrigste DNA Kopien Anzahl von Volumeneinheit definiert ist, die in 95% der Fälle festgestellt wird. Berechnen Sie die Anzahl der positiven Replikate von 24 Wiederholungen für jede Ebene von Plasmid Konzention. Bestimmen Sie die LOD 95% PCR. Die LOD 95% PCR ist das Niveau , das aus 24 Replikaten in der Detektion von 23 Replikaten positive Ergebnisse. Linearitätsbereich und Bestimmungsgrenze von qRT-PCR Anmerkung: Führen 4 unabhängige Versuche mit 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids , um sicherzustellen , dass die niedrigste Konzentration in dem Bereich verwendet wird, entspricht dem LOD 95% PCR zuvor in 4.3.10 bestimmt. Dispense 45 & mgr; l von Reinstwasser in 6 Röhrchen. Starten Sie die 6 zehnfache serielle Verdünnungen mit der Konzentration von Plasmid – Arbeitsverdünnung bis 10 7 LOD 95% PCR entspricht. Führen 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids. Jeweils 5 & mgr; l aus dem Plasmid Arbeitsverdünnung (bestimmt in Abschnitt 4.4.2) in das Röhrchen mit 45 & mgr; l von Reinstwasser. Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 4.4.3 bis zur letzten Rohr in der seriellen Verdünnung p erhaltenlasmid. Amplify die 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids, wie in Kapitel 2 beschrieben. Verfolgen Sie die lineare Regression y = ax + b mit einem für die Steigung und b für den Schnittpunkt (Abbildung 3). Berechnen Sie die Verstärkungseffizienz (E) aus der Steigung eine der Standardkurve (siehe 4.4.5) unter Verwendung der Gleichung: . Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1 bis 4.4.6 dreimal. Hinweis: Amplifikationseffizienz stellt die Menge an PCR-Produkt Erhöhung nach jedem Zyklus. Eine ideale Reaktion erreicht Wirkungsgrad von nahezu 100%. In der Praxis E (%) wurde zwischen 75% und 125%. Höhere E kann Amplifikation von unspezifischen Produkten oder Pipettieren Fehler in der seriellen Verdünnung an. Lower E kann in der Verdünnungsreihe, schlechte Primer-Design oder nicht optimalen Reaktionsbedingungen auch eine Pipettieren Fehler an. Berechnen Sie die Vorspannung (Tabelle3). Überprüfen Sie für jedes Plasmid – Ebene , die die absolute Bias – Wert ist kleiner als der kritische Bias – Wert (0,25 log 10). Bestimmen Sie die mittlere Vorspannung und die Linearität Unsicherheiten (U Lini) für jedes Plasmid – Ebene (Tabelle 3) , um die Leistung der linearen Regression für EHV-2 qPCR zu bewerten (Abbildung 4). U Lini ist die Linearität Unsicherheit für jeden bestimmt i Ebene Plasmid berechnet von Standardabweichung (SD'i) und mittlere Bias. Bestimmen Sie die kombinierte Linearität Unsicherheit (U LIN) von EHV-2 qPCR durch die Formel: Hinweis: Die Annahme der Vorspannung wird durch das Labor festgelegt (in der Regel absolute Bias 0,25 log 10) und entspricht der Differenz zwischen dem niedrigsten Wert und dem höchsten Wert von 0,5 log 10 (Menge in 10 Kopienzahl log gemessen). U LIN </sub> Wert könnte dazu beitragen, aus verschiedenen Laboratorien Leistung von qPCR zu vergleichen. Bestimmen Sie die Grenze der Quantifizierung der qRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR die niedrigste Konzentration mit einer Vorspannung von 0,25 log 10 für den Linearitätsbereich (Tabelle 3) verwendet wird. 5. Charakterisierung des gesamten Analysemethode (von DNA-Extraktion in der qRT-PCR-Ergebnis) Anmerkung: Die Charakterisierung des gesamten Verfahrens ist die Validierung aller notwendigen Schritte qRT-PCR – Daten zu erhalten (dh aus der Gewinnung von DNA aus den Atemprobe (siehe Abschnitt 1) zur Amplifikation und Quantifizierung des Ziels (siehe Abschnitt 2 )). Stellen Sie Korrespondenz zwischen der Kopien Anzahl in der PCR-Reaktion und die Kopien Nummer in der biologischen Probe mit der Formel: . Das <img alt="5.1-2" src="/files/ftp_upload/53672/5.1-2.jpg" /> Ist die Anzahl der Plasmid-Kopie in der PCR-Reaktion, das Volumen der Probe wird auf PCR zur Amplifizierung Mischung hinzugefügt, das Volumen von Puffer AVE verwendet Nukleinsäuren zu eluieren und ist das Volumen der entnommenen Probe. Testen Sie die Sensitivität und Spezifität des gesamten Analysemethode Hinweis: Nur bekannte EHV-2 positiv (oder negativ) Proben werden in diesem Abschnitt verwendet. Testen Sie die "Empfindlichkeit" der qRT-PCR-Methode von positiven Proben für das Ziel (EHV-2) zu analysieren. Wählen Sie EHV-2 positive DNA-Proben, die zuvor charakterisiert (positive Status). Extrahieren Sie die Nukleinsäure, wie in Kapitel 1 beschrieben, ein Verstärkungs Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Bestimmen Sie die Anzahl der realen Positive (positive Probendie positiv arbeitend sind mit dieser RT-PCR) und die Anzahl der falschen Negativen (bekannt positive Proben, die mit dieser RT-PCR-negativ sind). Testen Sie die "Spezifität" der qRT-PCR-Methode von negativen Proben zu analysieren Wählen EHV-2 DNA negativen Proben (negative Zustand). Extrahieren Sie die Nukleinsäure, wie in Kapitel 1 beschrieben, ein Verstärkungs Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Bestimmen der Anzahl von echten Negativen (negative Proben, die mit dieser RT-PCR-negativ bekannt sind) und die Anzahl von Fehlalarmen (bekannten negativen Proben, die mit dieser RT-PCR positiv sind). Berechnen Sie die "diagnostische Sensitivität" (Se) und "diagnostische Spezifität" (Sp) des gesamten Verfahrens (Tabelle 4) wie folgt: Se = Anzahl der realen Positive / (Anzahl der realen Positive + falsch negative Ergebnisse ) und Sp = Anzahl der realen Negative / (Anzahl der realen negativens + False Positives) (siehe Tabelle 4). Berechnen Sie die 95% Konfidenzintervall für Sensitivität und Spezifität des gesamten Verfahrens mit der Formel von Greiner und Gardner Beziehung 12,20: wobei e der geschätzte Fehler ist, θ der Se (oder Sp) und n die Anzahl der untersuchten Proben. Hinweis: Für eine kleine Anzahl von Proben, verwenden Sie die Schwartz Tabelle nach AFNOR – Norm 12 , um das 95% Konfidenzintervall für Sensitivität und Spezifität des gesamten Verfahrens berechnen. Herstellung der negativen Quellenmaterial zur Charakterisierung des gesamten Analysemethode ACHTUNG: Um die Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung des gesamten Verfahrens (LOD – Methode und die LOQ – Methode) zu bestimmen, fügen bekannten Konzentrationen von Plasmid zu den biologischen Proben , die frei sind dafür bekannt,des Targets (EHV-2 in diesem Fall). Diese Proben, zusammen mit dem quantifizierten Plasmid, bilden positive Standards , mit denen die LOD – Methode und die Methode LOQ zu bestimmen. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Ziel (EHV-2) in den biologischen Proben verwendet, um positive Standards konstruieren. Wählen Sie verschiedene bekannte negative biologische Proben. Extrahieren von biologischen Proben, wie in Kapitel 1 beschrieben, die Verstärkung Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Ziel durch das Fehlen von PCR-Signal in diesen Proben. Hinweis: Verwenden Sie die gleiche negative Ressource Material für alle Stufen zwischen 5,4 und 5,5. Pool, die verschiedenen negativen Proben zu 15 ml negativen Ressourcenmaterial zu erhalten (ein Volumen, das notwendig für die vollständige Validierung). Dispense 135 ul dieser negativen Ressource Material in 100 Röhrchen. Halten Röhrchen bei 4 ° C oder bei -80 ° C für lange Lagerung. Limit Nachweis des gesamten Analysemethode Bestimmen Sie die Minderungszone des gesamten Verfahrens. Dispense 45 & mgr; l von Reinstwasser in 6 Röhrchen. Führen 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids. Jeweils 5 & mgr; l aus dem Plasmid Arbeitsverdünnung bis 10 7 LOD 95% PCR entspricht mit 45 & mgr; l von Reinstwasser in das Röhrchen (wie in Abschnitt 4.3.10 festgelegt). Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 5.4.1.2 bis zum letzten Rohr in der seriellen Verdünnung erhielt Plasmid. Jeweils 5 & mgr; l von jeder Verdünnung von Plasmid 2 Röhrchen mit 135 & mgr; l der negativen Quellenmaterial 2 zu erhalten repliziert für die 6 positive Standards. Vortex und kurz Zentrifuge. Führen Sie die Extraktion der zwei Replikate für die 6 positive Standards, wie in Kapitel 1 beschrieben, die Verstärkung Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Bestimmen Sie die Minderungszone: die Zone zwischen dem letzten konzentration von Plasmid, das ein positives Signal und die erste Konzentration zu geben, die kein Signal zeigt. Nachweisgrenze der Methode (LOD – Methode) von 2 unabhängigen Trials Anmerkung: Führen 2 unabhängigen Versuchen der Nachweisgrenze des gesamten Verfahrens (LOD – Verfahren) zu bestimmen. Starten Sie die 6 zweifache serielle Verdünnungen mit dem Plasmid Arbeitsverdünnung, die 4-mal stärker konzentriert, dass die letzte Konzentration des Plasmid ist, das ein positives Signal gegeben (siehe Abschnitt 5.4.1.5). Dispense 25 ul Reinstwasser in 6 Röhrchen. Führen 5 zweifache serielle Verdünnungen des Plasmids. Transfer 25 ul aus dem Plasmid Arbeitsverdünnung in das Röhrchen mit 25 ul Reinstwasser (wie 5.4.2.1 in Abschnitt bestimmt). Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 5.4.2.3 bis zum letzten Rohr in der seriellen Verdünnung erhielt Plasmid. Jeweils 5 & mgr; l von jeder Verdünnung von plasmid bis 4 Röhrchen mit 135 ul des negativen Ressourcenmaterials 4 Replikate der 5 positive Standards zu erhalten. Vortex und Zentrifuge kurz auf die Rohre. Führen Sie die Extraktion der vier Replikate für die 5 positive Standards, wie in Kapitel 1 beschrieben, die Verstärkung Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.2.1 einmal 5.4.2.5 8 Wiederholungen für jede Ebene von Plasmid-Konzentration zu erhalten. Zählen Sie die Anzahl der positiven Wiederholungen von 8 Wiederholungen für jede Ebene von Plasmid-Konzentration. Bestimmen Sie die LOD – Methode. Die LOD – Methode ist die letzte Ebene , auf der 8 Wiederholungen von 8 Replikate positiv sind (wie in Abschnitt 5.4.2.7 beschrieben). Linearitätsbereich und Quantifizierungsgrenze des gesamten Analysemethode Hinweis: Um die Grenze der Quantifizierung des gesamten Verfahrens (LOQ – Methode) zu bestimmen, fügen bekannte Konzentrationen des Plasmid biologischenProben, die frei von dem Ziel (EHV-2 in diesem Fall) zu sein, sind bekannt. Diese Proben bilden positive Standards der LOQ Methode zu bestimmen. Dispense 45 & mgr; l von Reinstwasser in 6 Röhrchen. Führen 6 zehnfache serielle Verdünnungen des Plasmids. Jeweils 5 & mgr; l aus dem Plasmid Arbeitsverdünnung bis 10 7 LOD – Methode entspricht mit 45 & mgr; l von Reinstwasser in das Röhrchen (wie in Abschnitt 5.4.2.8 bestimmt). Vortex und Zentrifuge kurz das Rohr. Wiederholen Sie Schritt 5.5.2 bis zur letzten Rohr in der Verdünnungsreihe wurde das Plasmid erhalten. Jeweils 5 & mgr; l von jeder Verdünnung des Plasmid 2 Röhrchen mit 135 & mgr; l negative biologische Ressource Material 2 Replikate der 6 positive Standards zu erhalten. Vortex und kurz Zentrifuge. Führen Sie die Extraktion der zwei Replikate für die 6 positive Standards, wie in Kapitel 1 beschrieben, die Verstärkung Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1bis 5.5.4 dreimal. Definieren Sie eine Genauigkeit Profil zu bewerten, um und die quantitative Durchführung des Verfahrens zu bestätigen. Definieren Sie die Akzeptanzgrenzen des gesamten Verfahrens für das Labor. In diesem Protokoll werden die Akzeptanzgrenzen definiert als ± 0,75 Log 10 durch die labeo Frank Duncombe. Für eine Studie, Spuren eine erste lineare Regression y = ax + b (a ist die Steigung und b der Schnittpunkt ) mit einer Wiederholung von Ct – Werte für jeden Schätzwert der Standardkurve entspricht. Mit dieser ersten linearen Regression, die Berechnung der experimentelle Wert der Kopienzahl für die Replikate von Ct-Werte für diese erste Standardkurve verwendet. Wiederholen Sie Schritt 5.5.5.2 mit den zweiten Replikate von Ct-Werte, um eine zweite lineare Regression erhalten wird, und dem experimentellen Wert der Kopienzahl für die zweite Replikate von Ct-Werte für die zweite Standardkurve berechnen. <li> Wiederholen Sie Schritt 5.5.5.2 mit dem zweiten und dritten Studien. Berechnen Sie die Genauigkeit, Richtigkeit und Genauigkeitsgrenzen für jedes Plasmid Ebene nach NF U47-600-2 12. Erstellen Sie eine Tabelle, die Informationen für alle Standard-Punkte zu kompilieren (5.5.5.4) und erstellen Sie eine Genauigkeit Profil mit den zuvor definierten Akzeptanzgrenzen in 5.5.5.1 und die Richtigkeit der Daten zusammen mit den unteren und den oberen Genauigkeitsgrenzen wie in 5.5 berechnet .5.4 (Abbildung 5). Bestimmen Sie die LOQ Methode: das mit Richtigkeits 0,75 log 10 auf die niedrigste Konzentration einer Standardkurve entspricht , wie für den Linearitätsbereich berechnet in 5.5.5.5 verwendet. Bewertung der Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit Hinweis: Überprüfen Sie die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit, indem das Verhältnis zwischen der Standardabweichung unter Verwendung von und den Mittelwert von Wiederholungsmessungen (Variationskoeffizient oder CV = Standardabweichung /bedeuten). Bewerten Sie die Wiederholbarkeit der ganze Methode von 1 Analyst: Wählen Sie 3 biologischen Proben mit 3 verschiedenen viralen Genoms Lasten (zuvor in PCR zum Beispiel getestet). Auszug 8 Wiederholungen der drei Proben, wie in Kapitel 1 beschrieben, die Verstärkung Verfahren durchführen, wie in Kapitel 2 beschrieben. Berechnen Sie den Mittelwert und Standardabweichung des Ct – Wert für jede Probe gesammelt. Berechnen Sie die Intra-Assay-CV mit der Formel CV = Standardabweichung / Mittelwert. Bewerten Sie die Reproduzierbarkeit der Methode insgesamt um 3 Analysten: Wählen Sie 3 biologischen Proben mit 3 verschiedenen viralen Genoms Lasten (zuvor in PCR zum Beispiel getestet) Auszug 2 Wiederholungen der 3 Proben gewählt in 5.6.2.1 (wie in Abschnitt 1 beschrieben). Führen Sie die Verstärkung Verfahren wie in Abschnitt 2. Wiederholen Sie die Schritte beschrieben 5.6.2.2 von 2 unabhängigen Analysten. Berechnen Sie den Mittelwert und Standardabweichungdes Ct – Wert für jede Probe gesammelt. Berechnen Sie die Inter-Assay-CV mit der Formel CV = Standardabweichung / Mittelwert.