Création de Génome édités cellules souches pluripotentes humaines Lines: De Ciblage Isolement

Les procédures décrites dans ce manuscrit ont été examinés et approuvés par le Comité de surveillance de la recherche sur les cellules souches UC Berkeley. 1. Préparer cellules souches pour Édition Grow et cellules souches pluripotentes humaines culture (de hPSCs) sur une plaque à 6 puits contenant 2,4 × 10 6 cellules / plaque de la souris mitomycine C-inactivé fibroblastes embryonnaires (MEF) mangeoires cultivées sur de la gélatine 32. Maintenir hPSCs dans 3 ml de milieu de cellules souches embryonnaires humaines par puits (médias CSEh) et de grandir dans un 37 Incubateur ° C avec 3% de O 2/5% de CO 2. Remarque: Pour la réussite de ce protocole, il est pas nécessaire de maintenir hPSCs dans un incubateur faible teneur en oxygène; cependant il est important de noter que hPSCs prolifèrent plus rapidement dans un environnement de haute O 2, de sorte que les temps et le nombre de cellules doivent être ajustées en conséquence. Il convient également de noter que hPSCs maintenus en faible teneur en oxygène ont des taux inférieurs de différenciation spontanée 33. To rendre les médias 500 ml de CSEh combiner 380 ml de DMEM / F12, 75 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 25 ml KnockOut Serum Replacement (KSR). Ajouter glutamine (1 mM concentration finale), 5 ml 100x acides aminés non essentiels, 100 unités / ml de pénicilline-streptomycine (P / S), le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) (4 ng / ml de concentration finale), et le 2- mercaptoéthanol (5,5 uM de concentration finale). Changer médias en enlevant volume entier de presse (3 ml) à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacez-les par les médias de CSEh 3 ml tiède à l'aide d'une pipette sérologique. Répéter les médias changent tous les jours jusqu'à hPSCs sont environ 50% de confluence (jour -1). Un jour avant le ciblage (jour -1), changer de support de CSEh, en supprimant les anciens médias et ajout de médias de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632. Aussi le jour -1, préparer un à deux à 6 puits ou plaques de 10 cm de résistants des cellules nourricières MEF de drogue provenant de souris DR4 (2,4 × 10 6 cellules / plaque) 34. Remarque: En général, les plaques à 6 puits sont advantageous plus de plaques de 10 cm, comme ils accueillent plus de médias. Plaques à 6 puits assurent également que différents clones de différents puits sont indépendants. Toutefois, une plaque de 10 cm permet prélèvement plus facile, en fonction du microscope disponible pour ce processus. 2. Modification de cellules souches pluripotentes Préparer des solutions de transfection par aspiration 5 ug de chaque ZFN 1 et 2, TALEN 1 et 2, ou 15 pg de l'CRISPR / cas9 codant px330 plasmide (figure 1) dans un tube de 1,5 ml. Introduire à la pipette 30 pg du plasmide de réparation dans ce tube ainsi. Finalement, une pipette 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le tube pour amener le volume à 300 ul. Note: Préparer les plasmides en tant que Midiprep (n'importe quel kit est approprié) avec une concentration minimale de 300 ng / pl pour maintenir le volume total de la solution de transfection moins de 300 ul. Il est pas nécessaire d'effectuer une extraction au phénol / chloroforme, pour linéariser le plasmide, ou d'utiliser un endotoxin plasmide libre kit de préparation. Retirez le support du hPSCs aide d'une pipette de verre et de vide. Pipette 2 ml chaude 1x PBS dans chaque puits pour se laver les cellules. Retirez le PBS immédiatement en utilisant une pipette en verre et le vide. Ajouter 0,5 ml de 0,25% solution de trypsine-EDTA directement sur les cellules dans chaque puits. Placer à l'étuve (37 ° C / 5% CO 2 / O 2 à 3%) pendant environ 10 min. ou jusqu'à ce que la couche d'alimentation commence à décoller la plaque. Ajouter 2 ml de milieu chaud esWash (470 ml de DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unités / ml P / S) à chaque puits pour arrêter la réaction de la trypsine. Veiller à ce que des cellules nourricières se détacher comme une feuille. Pipeter le contenu de chaque puits dans un seul tube conique de 50 ml, en combinant tous les puits. Broyez les cellules en utilisant une pipette de 10 ml sérologique. Il est pas nécessaire de briser la couche d'alimentation; hPSCs se détache de la couche d'alimentation par trituration douce. Il devrait être d'environ 15 ml de la suspension cellulaire. Ajouter 25 ml de milieu esWash sur le tube pour amener le volumoi jusqu'à 40 ml au total. Permettre aux gros morceaux de desserte à se déposent au fond du tube pendant 1-2 min. Eliminer le surnageant (~ 38 ml) à partir du tube en utilisant une pipette sérologique et dépôt dans un nouveau tube conique de 50 ml. Isoler pendant 5 min à 190 x g. Retirer le surnageant du tube en utilisant une pipette en verre et le vide. Soyez sûr de ne pas perturber le culot cellulaire. Reprendre les cellules dans 500 ul PBS 1x. Mélanger avec une solution de transfection plasmidique préparé plus tôt. Compter les cellules à cette étape. Utilisez 5-10 millions de cellules par électroporation. Introduire à la pipette la totalité de la suspension de 800 pi dans une cuvette d'électroporation de 4 mm, placer sur la glace pendant 3-5 min. L'électroporation des cellules en utilisant le programme exponentielle sur le système d'électroporation avec les paramètres suivants: 250 V, 500 uF, résistance ∞, 4 mm et la taille de la cuve. Après électroporation, placer la cuvette de retour sur la glace pendant 3 min. Remarque: Respecter la constante de temps de l'électroporation sur le système d'électroporation. La constante de tempsvarie en fonction du nombre de cellules et la pureté de l'ADN. Transfections réussissent ont généralement une constante de temps entre 10-14 ms en utilisant les conditions énumérées et un pulseur de gènes II. Une efficacité moindre d'électroporation peuvent se produire lorsque des constantes de temps varie de ces valeurs. Reprendre cellules électroporées dans 18 ml chaude CSEh milieux supplémentés avec 10 uM Y-27632. Planche 3 ml de cette suspension cellulaire unique dans chaque puits d'une plaque à 6 puits avec des cellules nourricières DR4. Retour à l'incubateur (37 ° C / 5% CO 2/3% de O 2). 3. Sélection des colonies positives Jour 2, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacez-les par 3 ml de milieu de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632. Jour 3, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacer avec 3 ml de milieu de CSEh chaud sans y compris Y-27632. Jour 4, retirez tous les médias à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Remplacer avec 3 ml de milieu de CSEh chauds complétés avec des antibiotiques pour selectisur. Retour à l'incubateur (37 ° C / 5% CO 2/3% de O 2). Remarque: Le type d'antibiotique utilisée dépendra de la cassette de résistance incluse dans le modèle de réparation. Lorsque l'on travaille avec WIBR # 3 hPSCs (NIH registre 0079), 0,5 pg / ml de puromycine, 70 ug / ml de G418 (généticine), et 35 ug / ml d'hygromycine ont été utilisés avec succès. Les concentrations de sélection devraient être déterminées empiriquement en établissant la concentration minimale d'antibiotique nécessaire pour tuer les cellules de type sauvage en environ une semaine. 5-12 jours, changent quotidien des médias, en remplacement de vieux médias à chaque fois avec les médias de CSEh chauds complétés avec des antibiotiques. Remarque: Attendez-vous à une grande quantité de la mort cellulaire. Des colonies individuelles apparaîtront autour du jour 8-10. Médias CSEh régulière sans antibiotiques peut être utilisée après 12-14 jours de sélection continue. Si la densité cellulaire est élevée ou la mort cellulaire est lente, l'acidification des médias devrait être évitée et il peut être nécessaire d'augmenter les volu médiasmoi (jusqu'à 4-5 ml) pendant les quelques premiers jours de sélection. 4. Cueillette colonies sélectionnées (Jour 12-14) Observez les colonies sur les jours 12-14. Observez les colonies qui sont prêts à prendre sur un microscope de dissection et veiller à ce qu'ils ne contiennent pas de cellules qui commencent à se différencier. La taille approximative devrait être 800-1200 uM. Si les colonies atteignent cette taille avant le jour 12, il est recommandé qu'ils soient cueillis alors. Remarque: Pour chaque expérience de ciblage, ramasser autant de colonies que nécessaire pour assurer le génotype souhaité est isolé. A titre d'exemple, AAVS1 montage avec le modèle de réparation AAV-EGFP-CAGGS a montré intégration cohérente robuste, et ne nécessite que de 12 à 24 colonies à prélever pour obtenir environ 5 à 10 hétérozygote clones ciblés. D'autres expériences de ciblage peut exiger plus de colonies à être ramassés (tableau 1). La fréquence des événements de ciblage correct dépend de facteurs tels que l'efficacité de la SSN à introduire un ORD, la taille de l'insert, et la stratégie de sélection. Dans le cas de l'approche de piégeage de gènes pour le locus AAVS1 présentée ici, le marqueur de sélection est exprimé uniquement lorsqu'il est correctement intégré au site cible, réduisant le nombre de colonies requises pour obtenir un clone bien ciblée. Un jour avant la cueillette, préparer des plaques à 12 puits de MEF (2,4 × 10 6 cellules / plaque, un puits seront utilisés pour chaque colonie ramassé). Le jour de la cueillette, retirez tous les supports des plaques à 12 puits MEF utilisant une pipette en verre et le vide et le remplacer par 1 ml de milieu de CSEh. Aussi le jour de la cueillette, changer CSEh médias sur les plaques 6 puits qui vont être repris. Tirer pipettes en verre pour la dissociation mécanique des colonies individuelles à partir de la couche d'alimentation. Abaisser les pipettes sur un brûleur Bunsen capot et adoucie au point d'expansion jusqu'à ce verre est malléable. Enlever rapidement de la flamme et tirez la pipette créer en dehors d'un point angulaire. Casser lesignaler environ 2 cm de l'axe plié, laissant un étroit canal. Polir l'extrémité du canal par exposition à une flamme de 1 à 2 sec. Remarque: ramasser option colonies une pointe de pipette de p20, cependant, cela peut réduire la clonalité de la culture, comme la pointe terne peut déloger plus grandes quantités de cellules de chaque colonie dans les médias, potentiellement contaminant cueillettes ultérieures. Assemblez Dispositif de prise en prenant une pipette pointe de filtre p1000 et fixer une ampoule d'aspiration à l'extrémité étroite. Insérez la pipette en verre tiré à la fin de large. Placer une plaque de 6 puits de hPSCs à être capté sur la scène d'un microscope de dissection monté dans une hotte de culture de tissus. Comprimer le bulbe du dispositif de prélèvement et exciser doucement et coupez une colonie individuelle en 10-20 morceaux de taille égale, en prenant soin de ne pas libérer morceaux dans les médias. Prenez morceaux HPSC excisés de la colonie dans la pipette en libérant l'ampoule. Essayez de prendre aussi peu que possible les médias pendant le transfert. Transfer la colonie individu à un seul puits d'une plaque MEF 12 puits, en comprimant l'ampoule à nouveau directement dans le puits, libérant la colonie désormais rompu. Étiqueter chaque puits pour permettre l'identification unique d'une seule cellule clones dérivés. Répétez l'opération pour autant de colonies que nécessaire, en changeant la pipette de verre à chaque fois. Remarque: Cueillette colonies peuvent prendre un certain temps pour apprendre. Il est recommandé que la pratique de l'expérimentateur sur certaines cellules de contrôle avant de tenter d'isoler des colonies ciblées. Retourner plaques de 12 puits à l'étuve (37 ° C / 3% de O 2/5% CO 2), secouant délicatement la première plaque pour éviter l'accumulation de cellules dans le milieu de chaque puits. Le lendemain et les jours suivants avec, supprimer plein volume de support à l'aide d'une pipette de verre et le vide et le remplacer par 1,5 ml de milieu de CSEh chaud jusqu'à ce que les cellules sont d'environ 50% de confluence (cela prend habituellement 10-12 jours). Après 10-12 jours, en choisir un à deux colonies de chaque puits et transférer aux nouvelles plaques MEF-12 ainsi retourbage étapes 4.1-4.8 pour générer une plaque de réplique. Extraire l'ADN (voir ci-dessous) à partir des colonies restantes dans chaque puits des plaques originales MEF. Retirez le support de tous les puits à l'aide d'une pipette de verre et de vide. Pipette de 1 ml PBS 1X ONTO chaque puits pour laver les cellules. Retirer PBS en utilisant une pipette de verre et de vide. Introduire à la pipette 250 ul de tampon de lyse cellulaire (les concentrations finales dans H 2 O: Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS, 200 mM de NaCl, 0,08 mg / ml de protéinase-K) sur chacun des puits. Placer dans un incubateur (37 ° C / 3% de O 2/5% CO 2) O / N. Le jour suivant, le contenu de la pipette dans chaque puits des tubes de 1,5 ml individuels. Introduire à la pipette 250 ul de l'alcool isopropylique dans chaque tube pour précipiter l'ADN. Agiter le tube vigoureusement. Un précipité blanc doit être visible. Spin chaque tube bas pendant 3 min à 13000 rpm dans une centrifugeuse de dessus de table. Après rotation vers le bas, éliminer le surnageant par décantation dans les déchets liquides. Un petit culot d'ADN doit rester collé à la partie inférieure dele tube. Pipeter 250 ul de 70% d'éthanol dans chaque tube à laver le culot d'ADN. Secoue vigoureusement. Spin chaque tube bas pendant 3 min à 13000 rpm dans une centrifugeuse de dessus de table. Après tourner vers le bas, éliminer le surnageant par décantation dans les déchets liquides. Un petit culot d'ADN doit rester collée au fond du tube. Pipeter le reste du surnageant de sorte qu'il n'y a pas de liquide dans le tube gauche. Laissez tube ouvert à sécher sur paillasse pendant 5-10 min. Après séchage, remettre en suspension l'ADN dans du tampon TE 250 ul. Placez à 37 ° C pendant 6 heures pour permettre à l'ADN pour dissoudre. Génotype chaque échantillon en utilisant une stratégie de pré-optimisée PCR ou par transfert de Southern. Remarque:.. Pour AAVS1 ciblage en utilisant le modèle de réparation AAV-CAGGS-EGFP, la stratégie de transfert de Southern peut être trouvée dans Hockemeyer et al, 2009 4 Un protocole de transfert de Southern complète peut être trouvée dans le sud 2006 35 Pour multiplex génotypage par PCR de. la même expérience, les amorces et les conditions peuvent êtretrouvé dans le tableau 2 36. Jeter puits qui ne sont pas bien ciblées et de continuer à changer médias CSEh sur les cellules ciblées correctement tous les jours. Congeler bas les cellules quand ils sont environ 50% de confluence, voir ci-dessous pour la congélation protocole. Un jour avant la congélation, changer médias CSEh, en supprimant les anciens médias et ajout de médias de CSEh chaudes complété avec 10 uM Y-27632. Le jour de gel préparer 0,5 ml de chaque solution A et de solution B par puits d'une plaque à 12 puits qui est en cours de congélation dans 15 ml deux tubes coniques. La place des solutions sur la glace. Solution A: 50% des médias CSEh et 50% de FBS; Solution B: 80% de FBS et 20% diméthylsulfoxyde (DMSO). Dissocier les colonies HPSC en cellules individuelles avant de les congeler. Suivez les étapes de 2,2-2,8 pour ce faire, mise à l'échelle des volumes en conséquence. Culot cellulaire entièrement remettre en suspension dans 0,5 ml de solution A. Ajouter 0,5 ml de solution B à la suspension de cellules, une pipette de haut en bas pour faire la suspension de cellules homogène. Take au volume total de la suspension de cellules (~ 1 ml) et de dépôt dans un cryotube de 2 ml. Visser hermétiquement le couvercle. Lieu cryotube dans un congélateur à -80 ° C O / N. Le jour après la congélation, à éliminer les cellules congelées en provenance de -80 ° C congélateur et placer immédiatement dans le réservoir de l'azote liquide pour le stockage à long terme.