Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

La coclea a forma di spirale dell'orecchio interno, contenuto all'interno l'osso temporale, ospita l'organo del Corti, l'organo sensoriale uditivo fine nei mammiferi. La coclea è tonotopically organizzato e comunemente suddivisa in apicale, centrale e basale giri corrispondente alle regioni di frequenze diverse con rilevamento del suono ad alta frequenza nella base e il rilevamento a bassa frequenza nel vertice ^1. Le cellule cigliate, le cellule meccanosensoriali dell'organo di Corti, eseguire la lunghezza della coclea, della lunghezza di circa 6 mm in topi ^2,3. Queste cellule convertono l'energia meccanica delle onde sonore, che sono trasmessi attraverso il labirinto membranoso pieno di liquido, in segnali neurali che vengono elaborati dalle strutture uditive centrali. La tecnica qui descritta fornisce un metodo per preparare supporti interi dell'organo di Corti dopo calcificazione della coclea è completa (per i campioni che vanno da una settimana di vita adulta). Vi presentiamo anche un metodo per immunostavorazio il tutto montato tessuti cocleare. Supporti interi cocleari sono cruciali per la visualizzazione di tutte le cellule dei capelli e circostante cellule di sostegno nei loro arrangiamenti spaziali naturali e consentire l'analisi in tre dimensioni con l'uso della microscopia confocale.

Drs. Hans Engstrom e Harlow Ades originariamente descritto un intero metodo di montaggio dissezione cocleare nel 1966. Hanno dettagliato una tecnica per fissare rapidamente e sezionare coclee calcificata immersi in un liquido da una varietà di mammiferi, preservando brevi segmenti intatti dell'organo del Corti per l'analisi microscopica ^4. La dissezione di un unfixed, calcificata ratto coclea è stato illustrato in un video didattico ^5. Drs. Barbara Bohne e Gary Harding alla Washington University fatto diverse modifiche importanti a questo metodo. Nella loro versione del metodo cocleare tutto il monte, l'osso temporale era decalcificata, incorporato nella plastica, e cinque semi-spire o dieci quarti di giri erano dissezioneted ^6,7. Dr. Charles Liberman e colleghi Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye e Ear Infirmary, modificato questa tecnica in modo che embedding plastica non è stato richiesto ^8. Ulteriore modifica della tecnica si è verificato nel laboratorio del Dr. Jian Zuo in Ospedale dei Bambini St. Jude ^9-12, che ha informato il metodo di dissezione presentato qui. Usiamo una strategia diversa per accedere al dell'organo del Corti di Bohne e Liberman, che permette l'isolamento di apicale completo, medio, e si gira basali. Così il tessuto sezionato è più grande e meno probabilità di essere perso o danneggiato durante i processi di dissezione e di immunoistochimica. Inoltre, l'attuale metodo facilita misura della distanza dalla punta apicale o gancio basale per identificare una regione di frequenza.

Anche se molti laboratori svolgono immunocolorazione del tessuto cocleare, non è chiaro in cui questo metodo ha avuto origine. Di conseguenza ci sono varie ricette per il blocco buffers e buffer di incubazione anticorpo che possono influenzare le prestazioni di anticorpi primari individuali. Qui, presentiamo un metodo per immunocolorazione con anticorpi targhette fluorescenza che è applicabile agli anticorpi più comunemente usati nel campo uditivo.

La forma complessa della coclea, delicata struttura dell'organo del Corti, e encasement ossuto forniscono una sfida per l'analisi istologica e biochimica. Una varietà di tecniche sono attualmente utilizzati nel campo dell'udito di superare queste caratteristiche difficili e visualizzare le cellule all'interno dell'organo di Corti, ogni tecnica con i suoi vantaggi e svantaggi. Il protocollo presentato qui permette per tutta la dissezione monte della coclea topo adulto e, con leggera modifica, può potenzialmente essere utilizzato per esaminare le strutture critiche all'interno del coclee da una varietà di altri organismi modello utilizzato in campo.