זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות
Summary
The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.
Abstract
Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.
Introduction
מיזוג מצמוץ מקרי הוא צורה של מיזוג הפבלובית ומערכת מודל לחקירת המנגנונים העצביים של למידה וזיכרון אסוציאטיביים. זה נחקר במינים שונים, כולל בני אדם, ארנבות, חתולים, חולדות ועכברים. הפרדיגמה מקריא שני גירויים לזווג: גירוי מותנה ניטראלי (CS; למשל, בטון, בזק של אור, או גירוי זיף), וכן גירוי מותנה בולט (ארה"ב, לדוגמה, שרבוב אוויר לעין, או הלם periorbital). ארה"ב מעוררת תגובת מצמוץ מקרית מותנית, הרפלקסיבית (כלומר, UR). בסופו של דבר, לאחר כמה מצגות של CS-US לזווג, הנושא לומד לקשר בין CS עם ארה"ב. למידה זו באה לידי ביטוי בצורה של תגובה מותנית (CR), מצמוץ מקרי שהושר על ידי CS לבד שמקדים את המצגת של ארה"ב.
מיזוג מצמוץ מקרי בצורת עקבות כולל מרווח ללא גירוי של כמה שעותאלפיות undred שמפריד בין CS ובארצות הברית (איור 1). מיזוג Trace הוא צורה של למידה הצהרתית שכן הוא דורש מודעות של תלויות גירוי 1. הפער הזמני דורש החיה לשמור על "זכר" עצבי של CS באזורי מוח קדמיים כגון ההיפוקמפוס מנת שארה"ב ואת CS לקיים קשרים 1-6. יחד עם אזורי המוח הקדמיים, מיזוג עקבות תלוי גם המוחון 7.
מיזוג מצמוץ מקרי הוא, אם כן, הפרדיגמה שימושי לחקירה את הרב הגוני של זיכרון, לרבות רכישה, איחוד, ויחזור. במהלך מיזוג מצמוץ מקרי, קבוצת ביקורת של חיות מוצגת עם גירויים מזווגים בסדר אקראי כדי לבדוק תגובות pseudoconditioning או מרוגשים אל CS כי עלול להיגרם על ידי מצגת בארה"ב לבדה יותר מאשר בקשר CS-ארה"ב למד.
Appara נפוץtus לחקירת מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים הוא חדר שבו מכרסם רשאי לנוע בחופשיות במהלך תהליך ההכשרה 8-10. עם סוג זה של מכשירים, לקשור מצורף בדרך כלל כיסוי ראש כי היא מודבקת הגולגולת של המכרסם. את הרצועה מאפשרת המשלוח של ארה"ב (ולפעמים CS) ו להעברת התגובה של החיה לגירויים אלה (כלומר, תגובת המצמוץ המקרית) 10. לקשור עצמו עשוי להיות שונה בהתאם לסוג של גירויים נמסרו ואיך תגובת המצמוץ המקרית נרשמת.
הסיבה לשימוש "בחופשיות-נעו" עכברים קשורים למיזוג מצמוץ מקרי היא שעכברים להיאבק איפוק. למרות מינים אחרים עשויים להיות נוחים יותר לקבל איפוק, היתרון העיקרי של שימוש בעכברים בניסויי מיזוג מצמוץ מקריים הוא כי הרוב המכריע של זנים מוטנטים זמינים מהונדסים גנטי הם זני עכבר. בנוסף נאבק, מיל מלאtraint של עכברי תוצאות במצוקה חריפה. תכשיר עכבר קבוע ראש ממזער לחץ יגדיל את המידע הפיזיולוגי שניתן להשיג במהלך מיזוג מצמוץ מקרי. לדוגמה, מערכת זו תאפשר הדמיה של נוירונים בקליפת המוח עם מיקרוסקופיה 2-פוטון 11.
ראש-קבוע הכנות שמשו בניסויים קודמים עבור הדמיה אופטית של הקורטקס באמצעות שתלים גולגולתי נשלפים, הקלטות אלקטרו vivo של המוח המכרסם עם מערכי tetrode, שני פוטוני הדמית סידן, וגם כפלטפורמת מיזוג מצמוץ מקרי בעכברים 11 -16.
במערכת קבועת הראש, גירוי והקלטות אמינים מובטחים ללא ריסון מלא של העכבר (איור 2). כיסוי ראש כמו זה המשמש במערכת לנוע בחופשיות מודבקת הגולגולת של העכבר. במהלך אימונים, לא את הקצה העליון מודבק מחבר מחובר ברים מעל הליכון גלילי על מנת לייצב את ראשו של המכרסמים (איור 2 א). הליכון הגלילי מאפשר לעכבר לנוח בנוחות, אבל אם העכבר מעוניין בכך, גם מאפשר את זה כדי לרוץ או ללכת. עם השימוש במערכת זו, עכברים יכולים להיות מאומנים עם רטט זיף כמו CS לבין התחשמלות periorbital קלה כמו ארה"ב (איור 1). ארה"ב היא מועברת דרך חוטים להציב בניתוח מתחת לרוחב העור לעין. קל CS מועבר באמצעות מסרק המחובר מפעיל כיפוף מלבני 2 שכבתי (איור 2 ב). את מסרק הינע כיפוף ואז מחוברים בסיס מגנטי כי הוא עבר במקום הנכון בזמן אימון והוא מותאם בגין משלוח אופטימלי עבור כל חית פרט. מסרק ממוצבת שהיא רוכבת עליו השפם שנבחר. במהלך מסירת CS, אות נשלחת הינע כיפוף כי מחליף את המסרק מוביל הרטט של שפם 17.
<p class= "jove_content"> גירויים אחרים כגון בטון או בזק של אור שמשו גירויים מותנים יעילים עכברי 16,18,19 בעבר. הגירוי זיף הסיבה נבחר עבור CS ב פרדיגמה ניסויית זה היא התלות של חיות בעכברים על vibrissae שלהם עבור קלט מידע חושי במהלך חיפושים. גירוי זיף הוכח להיות CS אמין ויעיל 20. יתר על כן, בהתחשב המצע ומבוסס ומאורגן קליפת המוח של מערכת vibrissae (כלומר, בקליפה לחבית), גירוי זיף כמו CS מספק כלי אלגנטים למיפוי שינויים הקורטיקלית פלסטי הקשורות למידת מצמוץ מקרי מיזוג 20,21. מערכת קבועת ראש מאפשרת גירוי המדויק של שפם שנבחר להשוות תגובות בין הנוירונים מגורים ונוירונים קבלה תשומות מפאות הלא מגורה. לבסוף, זנים רבים של עכברים להפגין אובדן שמיעה כתוצאה מהזדקנות כמבוגר צעיר יחסית <sup> 22, וסגירת עפעף במהלך כהרף המותנה משנת CS ויזואלית (למרות CS ויזואלי עושה לשפר בעיות עם תגובות בהלה 16). גירוי זיף אינו מושפע משני של סיבוכים אלה.מתפרסמים כאן שינויים ייחודיים וחשובים על הכנות קבועות ראש אחרות למיזוג מצמוץ מקרי, כוללים שיטות למסירת CS וארה"ב, ורכישת תגובת המצמוץ המקרית. המהימנות של המנגנון הזה ואת הפרדיגמה הכשרת מיזוג מצמוץ מקרי מודגמת על ידי הלימוד עקום מעכברים ממוזגים עקומה למידה שטוחה יחסית מחיות מלאות pseudoconditioned (איור 7 א).
Protocol
Representative Results
Discussion
מיזוג מצמוץ מקרי קלסי הוא צורה של למידה אסוציאטיבית כי הוא כלי שימושי להבנת התשתית העצבית הבסיסית למידה וזיכרון. שיטות קודמות מועסקות מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים כגון עכברים מעורבים בתא שאפשר את החיה לנוע בחופשיות. תכשיר קבוע ראש למיזוג מצמוץ מקרי בעכברים, באמצעות המ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH-13-01-0243) לבין המכון הלאומי לבריאות (R37 AG008796). אנו מודים אלן בייקר בחנות המכונה של אוניברסיטת נורת'ווסטרן לבניית מנגנון גליל-קבוע הראש. אנו מודים לד"ר Shoai האטורי על הנחייתו ב Matlab ו- Solidworks. אנו מודים לד"ר ג'ון כוח עבור תוכנת LabVIEW ששלטה הניסוי.
Materials
| Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6" | Amazon | B002ONUM0E | For cylinder |
| Plexiglas | Custom-made; 1 cm thick | ||
| Metal Rods (12.7mm diameter) | Custom-made | ||
| 4-40 machine screw (.25 in long) | Amazon Supply | B00F33Q8QO | For cylinder |
| Classic Design Hair Comb | Conair | 93505WG-320 | For whisker stimulation |
| 2-Layer Rectangular Bending Actuator | Piezo Systems | T220-A4-303X | For whisker stimulation |
| Solder and Flux Kit | Piezo Systems | MSF-003-NI | For whisker stimulation |
| Magnetic Base | Thor Labs | MB175 | For whisker stimulation |
| Threaded rod for magnetic base | Custom-made | ||
| Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. | Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008 | ||
| TO-220 Style Transistor | Amazon Supply | B0002ZPZYO | For connector; for the wings |
| Relia-Tac Sockets | Electronic Connector Corp. | 220-S02 | For connector |
| Relia-Tac Pins | Electronic Connector Corp. | 220-P02 | For headpiece |
| 0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) | Amazon Supply | B000FN68EE | Locking Screw |
| 0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) | Amazon Supply | B000N2TK7Y | Locking Screw Head |
| Loctite Super Glue-Liquid | Loctite | 1365896 | Cyanoacrylic glue; for the locking screw |
| Quick Setting Epoxy | Ace Hardware | 18613 | For connector and whisker stimulation system |
| Ethernet Cable Wires | Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector | ||
| Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) | PlasticsOne | 005sw/2.0 37365 S-S | For headpiece, EMG and shock wires |
| Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) | AM Systems | 792800 | For headpiece, ground wires |
| Tenma Variable Autotransformer | Tenma | 72-110 | For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator |
| Amplifier | A-M Systems | 1700 | Amplifier for filtering and amplifying EMG signals |
| WPI A385R stimulus isolator | World Precision Instruments | 31405 | For the electrical shock |
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein: Animal Health | 50031 | For surgery; anesthesia |
| Buprenex Injectable CIII | Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc | NDC 12496-0757-1 | For surgery; analgesic |
| Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment | Akorn | NDC 17478-062-35 | Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia |
| Povidine-Iodine Prep Pads | PDI | NDC 10819-3883-1 | For surgery; antiseptic |
| Alcohol Prep Pads | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) | Integra Miltex | 4-7. | For surgery |
| Stainless steel surgical scalpel blades | Integra Miltex | 4-310 or 4-315 | For surgery; number 10 or 15 scalpel blade |
| 3% Hydrogen Peroxide | May be purchased from any standard pharmacy | ||
| Micro Clip | Roboz | RS-5459 | For surgery, to hold back skin |
| 00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long) | Amazon Supply | B002SG89X4 | For surgery, to wrap ground wire around |
| Professional Rotary Tool | Walnut Hollow | 29637 | Hand drill for surgery, to drill holes in skull |
| Inverted Cone Burr | Roboz | RS-6282C-34 | Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull |
| Engraving Cutter Drill Bit | Dremel | 106 | Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base | Parkell | S398 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder | Parkell | S399 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml | Parkell | S371 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip | Parkell | S387 | For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion |
| Swiss Tweezers, style #5 | World Precision Instruments | 504506 | For surgery |
| Puritan Cotton-Tipped Applicators | VWR International | 10806-005 | For surgery |
| Dental Caulk Grip Cement Kit | Dentsply | 675570 | For surgery; dental cement |
References
- Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
- Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
- Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit’s classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
- Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
- Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
- Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
- Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
- Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
- Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
- Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
- Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
- Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
- Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
- Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
- Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
- Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).
