Summary

זיף-אותת התניה קלסית ומצמץ בעיניה עכברי ראש הקבועות

Published: March 30, 2016
doi:

Summary

The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.

Abstract

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse’s head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.

Introduction

מיזוג מצמוץ מקרי הוא צורה של מיזוג הפבלובית ומערכת מודל לחקירת המנגנונים העצביים של למידה וזיכרון אסוציאטיביים. זה נחקר במינים שונים, כולל בני אדם, ארנבות, חתולים, חולדות ועכברים. הפרדיגמה מקריא שני גירויים לזווג: גירוי מותנה ניטראלי (CS; למשל, בטון, בזק של אור, או גירוי זיף), וכן גירוי מותנה בולט (ארה"ב, לדוגמה, שרבוב אוויר לעין, או הלם periorbital). ארה"ב מעוררת תגובת מצמוץ מקרית מותנית, הרפלקסיבית (כלומר, UR). בסופו של דבר, לאחר כמה מצגות של CS-US לזווג, הנושא לומד לקשר בין CS עם ארה"ב. למידה זו באה לידי ביטוי בצורה של תגובה מותנית (CR), מצמוץ מקרי שהושר על ידי CS לבד שמקדים את המצגת של ארה"ב.

מיזוג מצמוץ מקרי בצורת עקבות כולל מרווח ללא גירוי של כמה שעותאלפיות undred שמפריד בין CS ובארצות הברית (איור 1). מיזוג Trace הוא צורה של למידה הצהרתית שכן הוא דורש מודעות של תלויות גירוי 1. הפער הזמני דורש החיה לשמור על "זכר" עצבי של CS באזורי מוח קדמיים כגון ההיפוקמפוס מנת שארה"ב ואת CS לקיים קשרים 1-6. יחד עם אזורי המוח הקדמיים, מיזוג עקבות תלוי גם המוחון 7.

מיזוג מצמוץ מקרי הוא, אם כן, הפרדיגמה שימושי לחקירה את הרב הגוני של זיכרון, לרבות רכישה, איחוד, ויחזור. במהלך מיזוג מצמוץ מקרי, קבוצת ביקורת של חיות מוצגת עם גירויים מזווגים בסדר אקראי כדי לבדוק תגובות pseudoconditioning או מרוגשים אל CS כי עלול להיגרם על ידי מצגת בארה"ב לבדה יותר מאשר בקשר CS-ארה"ב למד.

Appara נפוץtus לחקירת מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים הוא חדר שבו מכרסם רשאי לנוע בחופשיות במהלך תהליך ההכשרה 8-10. עם סוג זה של מכשירים, לקשור מצורף בדרך כלל כיסוי ראש כי היא מודבקת הגולגולת של המכרסם. את הרצועה מאפשרת המשלוח של ארה"ב (ולפעמים CS) ו להעברת התגובה של החיה לגירויים אלה (כלומר, תגובת המצמוץ המקרית) 10. לקשור עצמו עשוי להיות שונה בהתאם לסוג של גירויים נמסרו ואיך תגובת המצמוץ המקרית נרשמת.

הסיבה לשימוש "בחופשיות-נעו" עכברים קשורים למיזוג מצמוץ מקרי היא שעכברים להיאבק איפוק. למרות מינים אחרים עשויים להיות נוחים יותר לקבל איפוק, היתרון העיקרי של שימוש בעכברים בניסויי מיזוג מצמוץ מקריים הוא כי הרוב המכריע של זנים מוטנטים זמינים מהונדסים גנטי הם זני עכבר. בנוסף נאבק, מיל מלאtraint של עכברי תוצאות במצוקה חריפה. תכשיר עכבר קבוע ראש ממזער לחץ יגדיל את המידע הפיזיולוגי שניתן להשיג במהלך מיזוג מצמוץ מקרי. לדוגמה, מערכת זו תאפשר הדמיה של נוירונים בקליפת המוח עם מיקרוסקופיה 2-פוטון 11.

ראש-קבוע הכנות שמשו בניסויים קודמים עבור הדמיה אופטית של הקורטקס באמצעות שתלים גולגולתי נשלפים, הקלטות אלקטרו vivo של המוח המכרסם עם מערכי tetrode, שני פוטוני הדמית סידן, וגם כפלטפורמת מיזוג מצמוץ מקרי בעכברים 11 -16.

במערכת קבועת הראש, גירוי והקלטות אמינים מובטחים ללא ריסון מלא של העכבר (איור 2). כיסוי ראש כמו זה המשמש במערכת לנוע בחופשיות מודבקת הגולגולת של העכבר. במהלך אימונים, לא את הקצה העליון מודבק מחבר מחובר ברים מעל הליכון גלילי על מנת לייצב את ראשו של המכרסמים (איור 2 א). הליכון הגלילי מאפשר לעכבר לנוח בנוחות, אבל אם העכבר מעוניין בכך, גם מאפשר את זה כדי לרוץ או ללכת. עם השימוש במערכת זו, עכברים יכולים להיות מאומנים עם רטט זיף כמו CS לבין התחשמלות periorbital קלה כמו ארה"ב (איור 1). ארה"ב היא מועברת דרך חוטים להציב בניתוח מתחת לרוחב העור לעין. קל CS מועבר באמצעות מסרק המחובר מפעיל כיפוף מלבני 2 שכבתי (איור 2 ב). את מסרק הינע כיפוף ואז מחוברים בסיס מגנטי כי הוא עבר במקום הנכון בזמן אימון והוא מותאם בגין משלוח אופטימלי עבור כל חית פרט. מסרק ממוצבת שהיא רוכבת עליו השפם שנבחר. במהלך מסירת CS, אות נשלחת הינע כיפוף כי מחליף את המסרק מוביל הרטט של שפם 17.

<p class= "jove_content"> גירויים אחרים כגון בטון או בזק של אור שמשו גירויים מותנים יעילים עכברי 16,18,19 בעבר. הגירוי זיף הסיבה נבחר עבור CS ב פרדיגמה ניסויית זה היא התלות של חיות בעכברים על vibrissae שלהם עבור קלט מידע חושי במהלך חיפושים. גירוי זיף הוכח להיות CS אמין ויעיל 20. יתר על כן, בהתחשב המצע ומבוסס ומאורגן קליפת המוח של מערכת vibrissae (כלומר, בקליפה לחבית), גירוי זיף כמו CS מספק כלי אלגנטים למיפוי שינויים הקורטיקלית פלסטי הקשורות למידת מצמוץ מקרי מיזוג 20,21. מערכת קבועת ראש מאפשרת גירוי המדויק של שפם שנבחר להשוות תגובות בין הנוירונים מגורים ונוירונים קבלה תשומות מפאות הלא מגורה. לבסוף, זנים רבים של עכברים להפגין אובדן שמיעה כתוצאה מהזדקנות כמבוגר צעיר יחסית <sup> 22, וסגירת עפעף במהלך כהרף המותנה משנת CS ויזואלית (למרות CS ויזואלי עושה לשפר בעיות עם תגובות בהלה 16). גירוי זיף אינו מושפע משני של סיבוכים אלה.

מתפרסמים כאן שינויים ייחודיים וחשובים על הכנות קבועות ראש אחרות למיזוג מצמוץ מקרי, כוללים שיטות למסירת CS וארה"ב, ורכישת תגובת המצמוץ המקרית. המהימנות של המנגנון הזה ואת הפרדיגמה הכשרת מיזוג מצמוץ מקרי מודגמת על ידי הלימוד עקום מעכברים ממוזגים עקומה למידה שטוחה יחסית מחיות מלאות pseudoconditioned (איור 7 א).

Protocol

כל הנהלים הקשורים עכברים בוצעו בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת נורת'ווסטרן ועדת שימוש סמך הנחיות שהוציא המכון הלאומי לבריאות. 1. צילינדר (איור 2 א) <li style=";text-align:right;…

Representative Results

8-10 השבוע גבר בן עכברי C57BL6 / J אומנו על מיזוג מצמוץ מקרי עקבות על מנגנון הליכון הגלילי-קבוע הראש. 8 עכברים אומנו עם מצגות CS-US לזווג (קבוצת מותנית) ו -9 עכברים אומנו עם מצגות CS וארה"ב מזווגות (קבוצת pseudoconditioned). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:rig…

Discussion

מיזוג מצמוץ מקרי קלסי הוא צורה של למידה אסוציאטיבית כי הוא כלי שימושי להבנת התשתית העצבית הבסיסית למידה וזיכרון. שיטות קודמות מועסקות מיזוג מצמוץ מקרי במכרסמים כגון עכברים מעורבים בתא שאפשר את החיה לנוע בחופשיות. תכשיר קבוע ראש למיזוג מצמוץ מקרי בעכברים, באמצעות המ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי משרד ההגנה (W81XWH-13-01-0243) לבין המכון הלאומי לבריאות (R37 AG008796). אנו מודים אלן בייקר בחנות המכונה של אוניברסיטת נורת'ווסטרן לבניית מנגנון גליל-קבוע הראש. אנו מודים לד"ר Shoai האטורי על הנחייתו ב Matlab ו- Solidworks. אנו מודים לד"ר ג'ון כוח עבור תוכנת LabVIEW ששלטה הניסוי.

Materials

Exervo TeraNova Foam Roller 36" x 6"  Amazon B002ONUM0E For cylinder
Plexiglas Custom-made; 1 cm thick
Metal Rods (12.7mm diameter) Custom-made
4-40 machine screw (.25 in long) Amazon Supply  B00F33Q8QO For cylinder
Classic Design Hair Comb Conair 93505WG-320 For whisker stimulation
2-Layer Rectangular Bending Actuator Piezo Systems T220-A4-303X  For whisker stimulation
Solder and Flux Kit Piezo Systems MSF-003-NI For whisker stimulation
Magnetic Base Thor Labs MB175 For whisker stimulation
Threaded rod for magnetic base Custom-made
Strips based on 221 series nylon strip connectors from Electronic Connector Corp. Custom-made, based on Weiss and Disterhoft, 2008
TO-220 Style Transistor Amazon Supply B0002ZPZYO  For connector; for the wings
Relia-Tac Sockets Electronic Connector Corp. 220-S02 For connector
Relia-Tac Pins Electronic Connector Corp. 220-P02 For headpiece
0-80 stainless steel machine screw (1 in. long) Amazon Supply B000FN68EE Locking Screw
0-80 stainless steel machine screw hex nut (5/32 in. thick) Amazon Supply B000N2TK7Y Locking Screw Head
Loctite Super Glue-Liquid Loctite 1365896 Cyanoacrylic glue; for the locking screw
Quick Setting Epoxy Ace Hardware 18613 For connector and whisker stimulation system
Ethernet Cable Wires Ethernet cable can be taken apart to use the individual wires for the connector
Polyimide coated stainless steel wires (2 in. long, .005 in. diameter) PlasticsOne 005sw/2.0 37365 S-S  For headpiece, EMG and shock wires
Stainless steel uncoated wire (.005 in. diameter) AM Systems 792800 For headpiece, ground wires
Tenma Variable Autotransformer Tenma 72-110 For the whisker stimulation; rheostat to adjust current to the bending actuator
Amplifier A-M Systems 1700 Amplifier for filtering and amplifying EMG signals
WPI A385R stimulus isolator World Precision Instruments 31405 For the electrical shock
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein: Animal Health 50031 For surgery; anesthesia
Buprenex Injectable CIII Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc NDC 12496-0757-1 For surgery; analgesic
Akwa Tears: Lubricant Ophthalmic Ointment  Akorn NDC 17478-062-35 Artificial tear ointment to prevent dry eyes while under anesthesia
Povidine-Iodine Prep Pads PDI NDC 10819-3883-1 For surgery; antiseptic
Alcohol Prep Pads May be purchased from any standard pharmacy
Stainless steel surgical scalpel handles (no.3) Integra Miltex  4-7. For surgery
Stainless steel surgical scalpel blades Integra Miltex 4-310 or 4-315 For surgery; number 10 or 15 scalpel blade
3% Hydrogen Peroxide May be purchased from any standard pharmacy
Micro Clip Roboz RS-5459 For surgery, to hold back skin
00-90 stainless steel machine screw (0.0625 in. long)  Amazon Supply B002SG89X4  For surgery, to wrap ground wire around
Professional Rotary Tool Walnut Hollow 29637 Hand drill for surgery, to drill holes in skull
Inverted Cone Burr Roboz RS-6282C-34 Inverted cone burr size 34; for surgery, to drill holes in skull
Engraving Cutter Drill Bit Dremel 106 Engraving cutter; 1.6 mm bit; for surgery, to drill holes in skull
C&B Metabond-Quick! Cement System "B" Quick Base Parkell S398 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Clear L-Powder Parkell S399 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System "C" Universal TBB Catalyst 0.7 ml Parkell S371 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
C&B Metabond-Quick! Cement System Ceramic Mixing Dish with temperature strip Parkell S387 For surgery; adhesive luting cement system; important to prevent headpiece avulsion
Swiss Tweezers, style #5 World Precision Instruments 504506 For surgery
Puritan Cotton-Tipped Applicators VWR International 10806-005  For surgery
Dental Caulk Grip Cement Kit Dentsply 675570 For surgery; dental cement

References

  1. Clark, R. E., Squire, L. R. Classical conditioning and brain systems: the role of awareness. Science. 280 (5360), 77-81 (1998).
  2. Thompson, R. F., Kim, J. J. Memory systems in the brain and localization of a memory. PNAS. 93 (24), 13438-13444 (1996).
  3. Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit’s classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
  4. Moyer, J. R., Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
  5. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
  6. Weiss, C., Disterhoft, J. F. Exploring prefrontal cortical memory mechanisms with eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 125 (3), 318-326 (2011).
  7. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
  8. Skelton, R. W. Bilateral cerebellar lesions disrupt conditioned eyelid responses in unrestrained rats. Behav Neurosci. 102 (4), 586-590 (1988).
  9. Takehara, K., Kawahara, S., Takatsuki, K., Kirino, Y. Time-limited role of the hippocampus in the memory for trace eyeblink conditioning in mice. Brain Res. 951 (2), 183-190 (2002).
  10. Weiss, C., Disterhoft, J. F. Evoking blinks with natural stimulation and detecting them with a noninvasive optical device: A simple, inexpensive method for use with freely moving animals. J Neurosci Meth. 173, 108-113 (2008).
  11. Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nature. 15 (5), 769-775 (2012).
  12. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  13. Lovett-Barron, M., et al. Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science. 343 (6173), 857-863 (2014).
  14. Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: the role of movement oscillations in eyelid conditioning. Front in Integ Neurosci. 5 (72), (2011).
  15. Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-Dependent Expression of Motor Learning during Eyeblink Conditioning in Head-Fixed Mice. J Neurosci. 34 (45), 14845-14853 (2014).
  16. Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuity. eNeuro. , (2015).
  17. Galvez, R., Weiss, C., Cua, S., Disterhoft, J. A novel method for precisely timed stimulation of mouse whiskers in a freely moving preparation: application for delivery of the conditioned stimulus in trace eyeblink conditioning. J Neurosci Meth. 177 (2), 434-439 (2009).
  18. Gruart, A., Sánchez-Campusano, R., Fernández-Guizán, A., Delgado-Garcìa, J. M. A Differential and Timed Contribution of Identified Hippocampal Synapses to Associative Learning in Mice. Cereb Cortex. , (2014).
  19. Weiss, C., et al. Impaired Eyeblink Conditioning and Decreased Hippocampal Volume in PDAPP V717F Mice. Neurobiol Dis. 11 (3), 425-433 (2002).
  20. Galvez, R., Weiss, C., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Vibrissa-signaled eyeblink conditioning induces somatosensory cortical plasticity. J Neurosci. 26 (22), 6062-6068 (2006).
  21. Galvez, R., Weible, A. P., Disterhoft, J. F. Cortical barrel lesions impair whisker-CS trace eyeblink conditioning. Learn & Memory. 14 (1), 94-100 (2007).
  22. Johnson, K. R., Zheng, Q. Y., Erway, L. C. A Major Gene Affecting Age-Related Hearing Loss Is Common to at Least Ten Inbred Strains of Mice. Genomics. 70 (2), 171-180 (2000).
  23. Tseng, W., Guan, R., Disterhoft, J. F., Weiss, C. Trace eyeblink conditioning is hippocampally dependent in mice. Hippocampus. 14 (1), 58-65 (2004).
  24. Joachimsthaler, B., Brugger, D., Skodras, A., Schwarz, C. Spine loss in primary somatosensory cortex during trace eyeblink conditioning. J Neurosci. 35 (9), 3772-3781 (2015).
  25. Boele, H. J. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Front in Cell Neurosci. 3 (19), (2010).
  26. Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. J Neurophysiol. 88 (4), 2124-2133 (2002).
  27. Ward, R. L., Flores, L. C., Disterhoft, J. F. Infragranular barrel cortex activity is enhanced with learning. J Neurophysiol. 108 (5), 1278-1287 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice. J. Vis. Exp. (109), e53310, doi:10.3791/53310 (2016).

View Video