Summary

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Published: January 15, 2016
doi:

Summary

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Abstract

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

Introduction

Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.

The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.

Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.

Protocol

Alle procedures hieronder beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd en uitgevoerd onder gesteriliseerde omstandigheden. 1. Wijziging van de GL261 cellen met vuurvliegluciferase Uiting Reporter OPMERKING: HIV-1-gebaseerde lentivirale vectoren tot expressie vuurvlieg luciferase (Fluc) onder controle van de milt focus vormende virus (SFFV) promoter. De optische reporter gen is gekloneerd in de vector plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. Handhaaf 293-T-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en GL261 cellen in RPMI medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 95 % lucht en 5% kooldioxide (CO 2). Wanneer de 293-T celkweek bereikt 80% confluentie in een T-75 kolf, was de cellen eenmaal met phosphate buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 3 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins schuin en verzamel alle cellen van de bodem van kolf. Breng de 3 ml trypsine celsuspensie in een 15 ml conische buis en voeg 7 ml vlees RPMI medium (in totaal 10 ml van de celsuspensie). Meng de celsuspensie goed met een pipet 5 ml. Neem 100 ul van de celsuspensie uit de buis en tel het aantal cellen met behulp hemocytometer. Hiervoor mix 100 ul van de celsuspensie met 300 pi trypan blauwe oplossing en voeg 2 pl van het mengsel in een hemocytometer. Tel het aantal cellen zonder blauwkleuring vier verschillende weergaven onder een microscoop. Het gemiddelde aantal cellen van elke weergave, omdat dit getal vertegenwoordigt 10 4 cellen / ml. Ondertussen, centrifugeer de buis met de celsuspensie bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 cellen met 2,5 ml RPMI-medium in een T-175 kolf met 27,5 ml DMEM (dag 1). Na 24 uur, vervang het medium met 20 ml vers DMEM (dag 2). Om de lentivirale vector produceren, meng 54 pl transfectie reagens met 2 ml serumvrij DMEM gedurende 5 min. Voeg 3 ug gag-pol, 3 ug van vesiculaire stomatitis G envelope (VSV-G), en 4,5 ug Fluc (pSIN-Fluc) in de DMEM met transfectie reagens en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Laat de gehele DNA-mengsel in 293-T kolf (T-175) en incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 48 uur (dag 2). Voeg 10 ml vers DMEM bij 24 uur na transfectie (totaal volume van 293-T celkweekmedium moet ongeveer 30 ml) (dag 3). Om GL261 cellen gesplitst in een24-wells plaat, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 5 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins gehelde Verzamel de cellen van de bodem van de kolf, en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2. Ondertussen, centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 cellen met 1 ml RPMI medium in een 24-well plaat (dag 3). Verzamel 30 ml van de lentivirale supernatant met 10 ml pipet uit de 293-kolf T (T-175) en 48 uur na transfectie en overdracht van de supernatant in 50 ml conische buis. Zuig het lentivirale 30 ml bovenstaande vloeistof via een injectiespuit 50 ml, door een 0,22 urn spuitfilter en aliquot het virale supernatant in 1 ml aliquots (dag 4). Vervang 1 ml RPMI middelmatige GL261 celplaatelektrode (24 putjes) met 1 ml van het supernatant lentivirale en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde kamer (dag 4). Na 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 6). Na 24 uur, herhaal de lentivirale infectie van de GL261 cellen (dag 7). Na de 2 e 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 9). Blijf de luciferase gemodificeerde GL261 cellen groeien (hierna aangeduid als GL261.luc cellen) en vergroten de celkweek aan een T-75 kolf. Wanneer de GL261.luc celkweek bereikt 70% confluentie in een T-75 kolf oogst van de cellen door behandeling met trypsine en tellen met een hemocytometer zoals in stap 1,2. Plate de GL261.luc cel in een 24-wells plaat bij afstuderen dichtheden (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellen / putje) en incuberen bij 37 ° C in een luchtbevochtigerfied kamer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet cellulaire luciferase activiteit ten opzichte Luciferase gemodificeerde U-87 MG (U87.luc) cellen met behulp bioluminescentie (figuur 1). Start de afbeelding software (klik op het pictogram op het bureaublad) en initialiseer de imaging-systeem (klik op "Initialize" knop). Initialisatie begint automatisch en kan enkele minuten duren voordat het systeem check-up en de camera afkoelen tot -90 ° C. Voeg 25 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) in elk putje. Incubeer de cellen met luciferine gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en de plaat voor 10 sec. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "10 sec" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de 24-well plaat op de imaging-station en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten. Nadat het beeld met succes is overgenomen, zal u een beeld venster en het gereedschap pa zienlette op het scherm. Klik op "ROI (regio's van belang) Tools" en selecteer 6 x 4 van het pictogram spleet. Maak 6 x 4 spleten aan de oppervlakte van het signaal op het imago van de 24-well plaat bedekken en klik op het tabblad metingen (potloodje). Observeren een venster met een lijst van ROI metingen eenheid van fotonen per seconde per steradiaal per vierkante cm (fotonen / sec / sr / cm2). Gebruik U87.luc cellen, eerder bewerkt met dezelfde lentivirus hier gebruikt voor GL261 modificatie 11, als een controle voor de beoordeling van luciferaseactiviteit in getransduceerde GL261.luc cellen. 2. In vitro Proliferatie assay Wanneer de GL261 en GL261.luc celculturen 70% confluentie bereiken in een T-75 kolf oogsten beide cellijnen door behandeling met trypsine en tellen als in stap 1,2, en plaat cellen in een 96-putjesplaat met een dichtheid van 1500 cellen in 80 ul van RPMI medium per putje met behulp van een multichannel pipet om tijd en pipetteren fouten te minimaliseren. Seed elke cellijn in 20 putten totaal. De verdamping in de putjes bevolkt door cellen te beperken, vul lege putjes met 100 pl vers RPMI medium. Beoordeel de cellulaire proliferatie met behulp van een colorimetrische celproliferatie assay. Hier gebruiken we de MTS-celproliferatie assay. Een multi-kanaal pipet wordt 20 pl MTS reagens in elk putje van de 96-well plaat die de cellen bevat. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet absorptie bij 490 nm met behulp van een microplaat reader. Dit wordt herhaald op dag 1, 2, 4 en 7 na plating. Om absorptiewaarden normaliseren, worden de waarden van elke dag gedeeld door de overeenkomstige waarden verkregen op dag 1 (Figuur 2). 3. Tumor Cell Implantatie Opmerking: Autoclaaf alle apparatuur. Bereid chirurgische gebied door het sproeien van een ontsmettingsmiddel (2% chloorhexidine oplossing) en bedek met absorbent gordijnen. Om steriele omstandigheden te handhaven, dragen steriele chirurgische handschoenen tijdens de operatie, en verdeel de chirurgische gebied in twee gebieden door kleur tape. Area 1 wordt het label "schoon" en bevat gesteriliseerd leveringen; Area 2 is gelabeld "vuile" en bevat gebruikte materialen. Voorafgaand aan chirurgie dier, bereiden een celsuspensie voor intracraniale injectie. Oogst cellen uit een 70% confluente T-75 kolf door behandeling met trypsine en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2, en een celsuspensie bij een dichtheid van 1,0 x 10 5 cellen / gl in Hanks 'uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg 2+ (HBSS). Verdoven muizen met intraperitoneale injectie van 200 pi mengsel dat 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine in 0,9% zoutoplossing. Om een ​​goede verdoving te bevestigen, knijp de teen van de muis. Als de muis volledig onder narcose moet de muis niet reageert op de stimulus. Toedienen van 0,1 mg / kg buprenorfine via subcutane injectie aan de postoperatieve pijn te verlichten. Scheren de bovenkant van het hoofd van de dieren met behulp van klippers en schoon met een katoenen tip applicator gedoopt in 2% chloorhexidine-oplossing. Gelden oogzalf om adequate smering tijdens de operatie te behouden. Maak een sagittale incisie ongeveer 1 cm lang over de parietooccipitalis bot met een steriele scalpel. Om de bregma visualiseren, veeg het oppervlak van de schedel met een katoen-tip applicator gedrenkt in een 3% waterstofperoxide-oplossing. Boor de schedel met een steriele 25-G naald een klein gat 3 mm rechts van de bregma en net achter het coronale hechtdraad maken. Opdat intracraniële injectie is tot een diepte van 3 mm van de schedel, cut 3 mm van de punt van een 20 ul pipetpunt met een schaar en plaats een injectiespuit in de pipetpunt. Steek de spuit loodrecht op het gat eerder gemaakte, en injecteer langzaam de tumorcel suspensioen met 3,0 x 10 5 cellen in 3 ul HBSS, over een periode van 1 min. Laat de naald in de plaats voor nog een minuut, en dan langzaam trek de naald. Zwabberen de schedel met katoen-tip applicator gedoopt in 3% waterstofperoxide en de 2% chloorhexidine-oplossing. Droog het oppervlak van de schedel met de katoen-tip applicator. Knip de steriele bot was ongeveer 3 mm 3 in grootte en bevestig het bot was op het einde van het katoen-tip applicator. Breng de been was om het gat met de katoen-tip applicator dekken. Teken de beide zijden van de hoofdhuid elkaar via schedel behulp van een tang en nieten om de wond te sluiten. Reinig de wond met een katoen-tip ondergedompeld in 2% chloorhexidine-oplossing. Monitor alle muizen post-operatief totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Gewoonlijk hersteltijd bedraagt ​​ongeveer 30 minuten. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. <p class = "jove_title"> 4. Bioluminescentie beeldvorming van GL261 tumorgroei Spray een ruime hoeveelheid ontsmettingsmiddel (0,05% dimethyl ammoniumchloride-oplossing) op een schone papieren handdoek. Gebruik de-desinfectiemiddel gedrenkte papieren handdoek grondig vegen de zwarte plaat, neus kegels en verdeler in de beeldvorming kamer waar de dieren in contact komen met het apparaat. Grondig veeg alle oppervlakken met een schone, droge papieren handdoek. Herhaal dit nog een keer en wacht 5 min. Initialiseren van de imaging station in stap 1.14.1. Verdoven de muis met een 300 pi mengsel dat 200 pl ketamine / xylazine en 100 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) door intraperitoneale injectie. Wacht 10 minuten na de injectie en bevestigen als de muizen volledig onder narcose door knijpen de staart. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "Auto" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de muizen op de beeldvorming statiop en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten. Zorg ervoor dat de tijd na de injectie is consistent met elke opnamesessie. Nadat het beeld met succes is overgenomen, moet een beeld raam en palet verschijnen. Klik op "ROI Tools" en selecteer "auto" van het icoon cirkel. Om ROI te definiëren, omringen het gebied van het signaal op de afbeelding, en neem dan de metingen van de ROI als eenheid van fotonen / sec / sr / cm2. Neem de muizen uit de beeldvorming kamer en het toezicht op de muizen totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Typisch hersteltijd is ongeveer 15 min. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. Monitor tumorgroei door bioluminescentie tweemaal per week totdat aanwezige dieren de volgende symptomen: gewichtsverlies (verlies van meer dan 20% van het gewicht vóór de implantatie), gebrek aan eetlust (complete anorexie voor 24 uur), en een gebrek aan duurzame purposeful respons op zachte stimuli (weak poging om omhoog), waarna ze moeten worden gedood. Euthanaseren dieren met deze symptomen met een CO 2 kamer, gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats muizen in de euthanasie kamer (niet overvol de kamer) en de instroom samengeperst CO 2 voor 5-6 min. Merk op dat alle dieren zijn bewusteloosheid en niet na ongeveer 5 min ademhalen. Neem de muizen uit de kamer. Zorg ervoor dat het hart niet klopt door het gevoel van de borst tussen duim en wijsvinger en controleer of er geen blink reflex. Weerhouden de muis in een buikligging op een vlakke ondergrond en het grijpen van de achterkant van de nek aan de basis van de schedel met de ene hand en de basis van de staart met uw duim en wijsvinger van de andere hand. Restrain het hoofd en snel de staart te trekken naar achteren. Zorg ervoor dat de schedel is gescheiden van de eerste halswervel met duim en wijsvinger. Normalize luminescentie waarden voor elke dag tegen corresponderende metingen verkregen bij de eerste dag van bioluminescentie als in stap 2,3 (Figuur 3A). Voor statistische analyse, het genereren van overlevingscurven met behulp van de Kaplan-Meier schatter 12 en vergelijk de verschillen tussen overlevingscurven met behulp van een log-rank test 13.

Representative Results

GL261 cellen werden geïnfecteerd met luciferase bevattende lentivirus zoals hierboven beschreven in stap 1. In vitro bioluminescentie illustratie robuuste luciferase-expressie vergelijkbaar met niveaus in de positieve controle U87.luc humane glioblastoma cellijn (Figuur 1). Zoals verwacht, niet-geïnfecteerde GL261 cellen tonen geen achtergrond luciferase expressie. Deze stap is eenvoudig cruciaal te voeren voordat verdere studies op de geïnfecteerde cellijn stabiele luciferase expressie te bevestigen. Luciferase-expressie na intracraniale implantatie. Voor intracraniale implantatie we lieten geen verschil in vitro groeisnelheid van GL261.luc opzichte GL261 cellen (Figuur 2). Voor intracraniële groei en overleving analyse werden cellen geïnjecteerd in de brAins van C57BL / 6 muizen per protocol stap 3. tumorgroei in muizen die tumoren GL261.luc werd serieel geanalyseerd op bioluminescentie beeldvorming met behulp protocol stap 4 en toonde detecteerbare tumorgroei (Figuur 3A). Muizen snel en consequent lager GL261.luc tumoren werd stervende en werden gedood. Belangrijk is er geen verschil in overall overleving tussen GL261.luc en GL261 tumordragende dieren (figuur 3B). In vivo bioluminescentie kan derhalve worden gebruikt om de respons op experimentele glioblastoma behandelingen volgen. Snelle betrouwbare tumorgroei en korte overleving kunnen grote hoeveelheden data op in een relatief korte tijd. Figuur 1. Luciferaseactiviteit in GL261.luc cellen. U87.luc, GL261.luc en GL261 (negatieve controle) cellen werden bij dichtheden van1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4 en 2,5 x 10 4 cellen / putje van links naar rechts. Luminescentie (foton / sec / sr / cm2) werd gemeten door het Lumina imaging station. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2. Luciferase-expressie geen invloed GL261 celproliferatie. GL261.luc cellen niet veroorzaken verschil in proliferatie zoals aangetoond door MTS celproliferatie assay. De grafiek laat voudige toename ten opzichte van dag 1, zoals bepaald door de gemiddelde absorptiewaarde vergelijking (gemiddelde ± SEM) en thespecified tijdstip de gemiddelde waarde op dag 1 (ongepaarde t-test-waarden vergelijkingentussen elke cellijn: P = 0,7796) 14. Fout balken geven de gemiddelde waarden (gemiddelde ± SEM) van viervoud monsters op elke dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3. Luciferase-expressie dosis geen effect op in vivo tumorgroei en overleving van dieren. (A) Bioluminescence bewaking toont progressieve groei van intracraniële GL261.luc tumor in C57BL / 6 muizen. (B) Kaplan-Meier survival analyse toont geen verschil in de totale overleving voor muizen intracraniaal geïmplanteerde met ofwel GL261 (vaste lijn) of GL261.luc cellen (stippellijn).Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

GL261 muizen glioomcellen, wanneer intracraniaal geïmplanteerde syngene immuuncompetente in C57BL / 6-muizen, bieden een aantal voordelen in vergelijking met humane glioma xenograft diermodellen. Veel van xenogetransplanteerde tumoren groeien als ingekapselde letsels die niet nauwkeurig niet herhalen de invasieve ziekte bij de mens. Daarentegen GL261 tumor toont niet alleen invasie in aangrenzende hersenen, maar ook neovascularisatie, mitotische figuren en diepe necrose 7. Het belangrijkste is het bestuderen tumorimmunologie of immunotherapeutische strategieën 15, 16, de C57BL / 6 muis behoudt een intact immuunsysteem 8. Eerdere studies hebben aangetoond robuuste expressie van het immuunonderdrukkende cytokine TGF-β en intracraniale tumoren bevatten immunosuppressieve T-regulerende cellen vergelijkbaar met humane glioblastoma 9, 10.

De eenvoudige techniek beschreven maakt stabiele expressie van luciferase door GL261 cellen. We hebben onlangs gemeld Similar in vitro en in vivo groei van cellen GL261.luc opzichte GL261 cellen naast soortgelijke tumor histologische kenmerken en immuuncel 17 infiltreren. GL261.luc cellen stabiel tot expressie luciferase die de oxidatie van het substraat luciferine omzetten van chemische energie fotonen en dus detecteerbaar licht katalyseert. Luciferine kan veilig worden toegediend aan dieren en passeert de bloed-hersenbarrière na intraperitoneale of intraveneuze injectie. In kleine proefdieren, zoals muizen, kan de bioluminescentie extern worden gedetecteerd in een niet-invasieve manier 11. Daarom kan tumorgroei serieel worden geëvalueerd zonder dat dierenoffer of dure MRI of CT-beeldvorming.

De kritische stappen in het protocol omvatten, niet alleen de lentivirale transductie, maar ook de controle van de stabiele expressie van luciferase in vitro alvorens te beginnen met in vivo experimenten. Verlies van transductie kan buitere herhalen lentivirus infectie. Invoering van een antibioticum resistentiegen in de expressievector kan ook worden gebruikt om te selecteren op luciferase-expressie. Zorgvuldige techniek vereist intracraniale implantatie reproduceerbaar plaats een substantieel aantal cellen in een exacte anatomische locatie aan vergelijking van verschillende behandelingsgroepen toelaten. Een belangrijk verschil tussen de huidige studie en eerdere studies van luciferase expressie GL261 cellen is het gebruik van een vrije hand techniek voor het implanteren van cellen in vergelijking met het gebruik van een stereotactische kader 18. We hebben eerder aangetoond consistente implantatie resultaten met de vrije hand techniek 19. Het voordeel van de vrije hand techniek is het vermogen om hoge doorvoer analyse van verschillende behandelingsmiddelen voeren. In onze handen, kunnen we ongeveer 60 dieren geïmplanteerd in 1 uur.

Na het beheersen van de techniek, de toekomstige toepassingen van de techniek zijn eindeloos. Zoals GL261 demonstrates verhoogde mitose en snelle tumorgroei vergelijkbaar met humane glioblastoma, kunnen antiproliferatieve behandeling geëvalueerd. Evenzo kunnen anti-invasieve en anti-angiogene therapieën worden gebruikt als GL261 tumoren invasief en angiogene. Voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het beoordelen van het effect van chemotherapeutische middelen die gericht zijn op de menselijke doelen. In vergelijking met eerdere studies gebruik te maken van de menselijke glioblastoma xenograften uiten luciferase 20, zou dit worden beschouwd als een beperking van ons model. Ook kan het effect van immunotherapeutische strategieën tumorgroei bestudeerd in de GL261 xenotransplantatie model.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.

Materials

D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechonology LUCK-100 Store away from light
Living Image Software Caliper Life Sciences Contact for Quote none
Xenogen Lumina Caliper Life Sciences Contact for Quote none
24-well; Standard tissue culture; flat-bottom Falcon 353047
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay  Promega G3582 none
Synergy 2 Multi-Mode Reader BioTek Contact for Quote none
96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed Coster 3603 none
Ketaset Pfizer NDC 0856-2013-01 Control substance
Xylazine Sigma-Aldrich 23076-35-9 none
28G Needle (with syringe)  Fisher   22-004-270 AKA Insulin Syringe
2% Chlorhexidine Fisher NC9756995 AKA “Nolvasan”
3% Hydrogen Peroxide Fisher H312P-4 Store away from light
Ophthalmic Ointment Cardinal Health 1272830 AKA “Akwa Tears”
25G 1 1/2 needle BD Becton Dickinson 305127 none
Disposable Scalpels Feather 2975 No. 21
Gauze Fisher 22028563 Autoclave before use
Heating Pad Dunlap HP950 none
Skin Stapler, Staples, Remover Stoelting 59020 none
PDI Alchol Prep Pads Fisher 23-501-711 none
Reflex 7mm Wound Clips 100 pack Brain Tree Scientific, INC 203 1000 Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Applier Brain Tree Scientific, INC 204 1000 Autoclave before use
Reflex 7mm Wound Clip Remover Brain Tree Scientific, INC 205 1000 none
Single Ended Round Tip Swab with Wood handle Qosmedix 10107 Autoclave before use
Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) Gibco 14170-112 none
Hamilton Syringe Hamilton 80300 none
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2961 none
Bone Wax Harvard Apparatus 599864 none

References

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. . Statistical Methods in Medical Research. , (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Play Video

Cite This Article
Clark, A. J., Fakurnejad, S., Ma, Q., Hashizume, R. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (107), e53287, doi:10.3791/53287 (2016).

View Video