דור של אגרגטים של תאי עכבר גזע עובריים שצג שבירת סימטריה, קיטוב והתנהגות קולקטיבית מתהווה<em> במבחנה</em
Summary
We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.
Abstract
פיתחנו פרוטוקול שיפור תרבות נוכחית Embryoid הגוף (EB) המאפשרת הלימוד של ארגון-עצמי, שבירת סימטריה, התארכות צירית ומפרט גורל תא באמצעות אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) בתרבות השעיה. מספר קטן של mESCs יקובצו במדיום בסיסי במשך 48 שעות ב96-גם צלחות שאינן רקמות שטופלו תרבות, תחתית-U, לאחר שהם המוסמכים להגיב לאותות ניסיוניים. בעקבות טיפול, אגרגטים אלה מתחילים להראות סימנים של ביטוי גנים מקוטב ולשנות בהדרגה המורפולוגיה שלהם ממסה כדורית של תאים למבנה מוארך, מאורגן היטב בהיעדר רמזי סימטריה חיצוניים. מבנים אלה הם לא רק מסוגלים להציג סמנים של שלוש השכבות נבט, אך באופן פעיל להציג תנועות כמו gastrulation-, שמעידות ליפה כיוונית של תאים בודדים מהצבירה, אשר מתרחשת באופן מכריע אזור אחד של המבנה המוארך. protoc זהol מספק שיטה מפורטת ליצירה לשחזור של אגרגטים אלה, גירוים עם אותות כגון הפעלת Wnt / β-קטנין ועיכוב BMP וניתוחם על ידי נקודת זמן אחת או מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות. בנוסף, אנו מתארים שינויים נהלים מכתים עובר הנוכחיים כל הר עכבר לניתוח immunocytochemical של סמנים ספציפיים בתוך אגרגטים קבועים. השינויים במורפולוגיה, ביטוי גנים ואורך של אגרגטים ניתן למדוד כמותית, מתן מידע על איך אותות יכולים לשנות גורלות צירי. זה שחזה כי מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם לחקר אירועים התפתחותיים המוקדמים כגון פיתוח צירי וארגון, ואופן רחב יותר, התהליכים של ארגון עצמי וקבלת החלטות סלולרית. היא עשויה גם לספק נישה מתאימה לדור של סוגי תאים קיימים בעובר, כי הם בלתי ניתנים להשגה מהתרבות חסיד קונבנציונלית כגון תאי עצב בחוט השדרה ומוטוריים.
Introduction
הלימוד וההבנה של החלטות תא-גורל בפיתוח יונקים המוקדם יכולים לעשות שימוש בתרביות של תאי גזע העובריים (ESCs), אוכלוסיות משובטים נגזרות מblastocysts שיש את היכולת עצמית לחדש ולהתמיין לכל סוגי התאים של אורגניזם כלומר., הם 1,2 pluripotent. בעוד תרבויות אלה היו וממשיכים להיות שימושיים להבנת הבסיס המולקולרי של תא החלטות-גורל, הם אינם מסוגלים להתרבות חלק מההסדרים במרחב ובהתנהגויות הגלובליות שנוצרו בעוברים במהלך gastrulation. בעובר, התהליך של gastrulation הופך שכבת האפיתל אחת לשלוש שכבות נבט שונות ומעניק את העובר עם ארגון anteroposterior גלוי 3-5. ניסיונות לשחזר את האירועים הללו vivo לשעבר היו מבוססים על הדור של אגרגטים תלת ממדיים של ESCs, התייחס לגופי embryoid כ( EBS), ולהעמיד אותם לאo תנאי בידול 6,7. ניתן שידלו אגרגטים אלה להתמיין לסוגים רבים ושונים של תאים, שחלקם גם אינם מסוגלים להשיג או מושרה עם יעילות נמוכה בתרבות חסיד או לא יכול להיות מיוצרים בכל;. לדוגמא, תאי דם 8 ונבט קדמוני 9. הגבלה בשימוש בEBS עם זאת, היא שהם אינם מסוגלים להציג את התנהגות המוךפו"גנטי, הפצת שכבת נבט או ארגון צירי כי הם מאפיינים עיקריים של העובר המתפתח, וכתוצאה מכך חוסר הארגון המרחבי 6,10. בדו"ח אחד, טיפול של EBS עם Wnt מוביל לקיטוב חלש בביטוי גנים בחלק אגרגטים אבל לא המורפוגנזה ברורה הוא ציין 7. בדיווחים האחרונים יותר, EBS שכבר בתרבית לתקופות ממושכות של זמן לפתח מבנים קדמי כגון רשתית, קליפה ותאי חישה באוזן פנימית, המחקים את העמיתים העובריים שלהם, אבל בלי לפתח ההקשר של organizat ציריהיון 11-13.
דו"ח של Marikawa et al. 14, תוך עבודה עם אגרגטים של קרצינומה תאים עובריים P19 העכבר (EC) שהוקמו על ידי שיטת תלייה-הטיפה, דיווח את הופעתה של מבנים מוארכים ממוצא mesodermal מזכיר המוארכים שהם נצפו עם exogastrulae בדו-חיים ועוברי קיפודי הים וקלר explants 15-18. כמו זה שלא נצפה עם תאי גזע עוברי של עכבר (mESCs), ניסינו לשחזר את ההתנהגות שנצפתה עם P19 תאי EC באמצעות אגרגטים של mESCs 19 ואנו מדווחים תנאי תרבות שמובילים לסימטריה שלהם לשבור והתארכות צירית. הבדל חשוב מהעבודה עם תאי P19 הוא שפרוטוקול הצבירה המתואר כאן מתבצע בצלחת 96-היטב, דומה לזה שתואר על ידי Eiraku et al. 20, במקום תלוי טיפות. שינוי זה הביא להתייעלות במונחים של התאוששות כוללת והן בשחזור התוך והבין-ניסיוני. חשוב לציין, שמירת אגרגטים בבארות בודדות מבטיחה היתוך שבין אגרגטים (נפוץ כאשר איגום אגרגטים מטיפין תלויות) אינו מתרחש. בנוסף, תכונה מרכזית של הפרוטוקול היא 24 שעות חשיפה לCHI99021 מעכב GSK3 (צ'י), activator חזק של איתות Wnt / β-קטנין, הבאים צבירה.
השיטה המתוארת כאן מספקת בסיס להבנת התהליכים של ארגון עצמי, ארגון צירי ומפרט שכבת נבט בתרבות, המאפשרת הסקת מסקנות להתבצע לגבי פיתוח צירי in vivo 19,21. מסיבות אלה השיטה יש הפוטנציאל לאפשר ניתוח מכניסטית מפורט של תהליכים שעלולות להיות קשה ללמוד בעובר. יתר על כן, יישום פוטנציאל הוא בדור של רקמות ואיברים שאינם בר השגה בקלות בתרבות חסיד בשל חוסר נישה סלולרית מובנה כגוןחוט השדרה מבשרי 21 ומנוע תאי עצב. תרבות הכוללת תלת ממדים מציעה מבנה פיזי וסביבה מאותתת כי לא יכול להיות בר השגה באמצעים קונבנציונליים, שהוביל לגישה חדשה לגזירה של שושלות עובריות באופן מאורגן במרחב.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה המתוארת בכתב היד הזה ביעילות ובreproducibly יוצרת אגרגטים של תאי גזע העובריים של עכבר (mESCs) שתצוגה מאורגנת סימטריה-שבירה והתארכות 19, שילוב של שניהם תרבות ירידת תלייה שתוארה על ידי Marikawa et al. 14 וEB היווצרות. אגרגטים אלה להמשיך לפתח מוארכים וציריים, משלימים שיטות קיימות לדור של איברים קדמי מתאי גזע עובריים כגון כוסות אופטיות 11 וקליפת המוח 13, ומכילים תאים עם זהותם של שכבות שלוש נבט בי תצוגת תהליכים דומים לאלה בgastrulation כמו 19,21 תנועת תאים מהירות.
זה מעניין, להעלות השערות על אופי האירוע שבירת הסימטריה, שכן הוא מתרחש בהעדר רקמות דפוסים חיצוניים וסימטרית zygotic מקלות 19. ההיווצרות הספונטנית של ציר בסיסי יכולה לנבוע מקיימת מראש heterogeneities בתרבות החל מתאים, המהווים את הבסיס לפיתוח של א-סימטריה. ואכן, אוכלוסיות של תאים בתרבית בתנאי ESLIF להציג תערובת של עצמי חידוש והבחנת תאים, הפרופורציות היחסית של אשר עשויות להשתנות מצבירה אחד למשנהו. יתר על כן, עבודה ראשונית במעבדה שלנו מצביעה על כך שאגרגטים מאוכלוסייה מלא pluripotent של תאים להראות התפתחות מאוחרת ופגמים בדפוסים, המצביע על תפקיד להטרוגניות בהיווצרות דפוס מאורגן (DA טרנר וא מרטינז אריאס, בהכנה). כדאי גם בהתחשב בכך שמנגנון תגובה-דיפוזיה עלול ליצור הדפוס, עם דיפוזיה של מעכב מהמשטח של כולל. Warmflash et al. 41 מצביע על כך שמנגנון כזה יכול להיות אחראי על פיתוח סימטריה רדיאלית בתרבות חסיד, מה שהופך אותו למועמד אפשרי לדפוסים בשלושה ממדים.
במהלך initiaתקופת צבירת 48 שעות l, תאים להגיע למצב דומה לזה שבתוך epiblast postimplantation, שבו הם המוסמכים להגיב לאותות מהמדיום המשני 19,21,24. בדרך כלל, הפרוטוקול המתואר כאן מספק תאים עם דופק של מדיום המשני המכיל גורמים (כמו אגוניסטים Wnt / β-קטנין) המספקים את האותות מספיק להתארכות. שיטות קודמות תרבות שתוארו על ידי et al לנקסטר. (באמצעות ESCs 13 בני האדם) וEiraku אל. (עם mESCs 11) משמש et תקופה קצרה של צבירה נמוכה בהידבקות 96-גם צלחות לפני תאים מצטברים הועברו לטיפי Matrigel למאזניים הולך תרבות. למרות הזמן בין הצבירה והכנסת Matrigel היה שונה בין המחקרים, בשני המקרים, מספר גדול של תאים ששימשו להיווצרות המצרפי (כ 3,000-4,500 תאים). בניגוד לכך, הפרוטוקול מתואר כאן 19 משתמשים בהרבה פחות תאים (כ 400 תאיםלצבירה) שנקבע להיות חיוני לתהליך של התארכות, סימטריה-שבירה והקיטוב שהוא ציין 19. בנוסף, מבנים מוארכים אלה יכולים להיות שנוצרו בתקופת זמן קצרה הרבה יותר ללא הטבעה במטריצות מלאכותיות: להשוות את הדור של אזורים במוח שהוגדרו על ידי אל נקסטר et (> 20-30 ימים) 13 ואופטי כוסות מEiraku. et al. (~ 11 ימים) 11 עם 5 ימים הנדרשים לייצור מבנים מוארכים מקוטבים.
אחת המגבלות בשיטת התרבות המתוארת כאן לעומת זאת, הוא שהם יכולים להיות מתורבת רק כ 5-6 ימים לאחר ציפוי עד הגודל שלהם הופך אותם מוסמך תחת כובד לשקוע לתחתית של הבארות ולאלץ את הידבקות אפילו על אי פלסטיק כלי -coated. ניסויים נוספים באמצעות מטריצות מלאכותיות כגון אלה שהוזכרו קודם לכן, אולי יאפשר לנו להגדיל את התקופה שלתצפית וניסויים, ועבודה הוא לקבוע את ההשפעות של הגבלת המצרפים באופן שוטף. מגבלה נוספת של שיטה זו היא שכדי לשנות את המדיום מבלי להסיר אגרגטים, נפח קטן של מדיום יש להשאיר בתחתית הבאר. ההשלכות לגנטיקה כימית גישות הצורך לשקול דילול זה וכל השפעה שיורית מתקשורת הקודמת: ביום דופק צ'י 3 מיקרומטר, 2.37 מיקרומטר פתרון הוא למעשה נמסר, ושינויים בינוניים לאחר לגרום לשאת על של .499 מיקרומטר (72-96 שעות) ו0.105 מיקרומטר (96-120 HR) בין נקודות הזמן. העבודה נוכחית לא תיקנה לדילול, ויש להניח כי שינויים בינוניים יומיים יהיו למזער השפעה שיורית.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח שחזור שני התוך והבין-ניסיוני. ראשית, תרבות המוצא של mESCs חייבת להיות מטופחת ולא על שיתוףnfluent, ובינוני תמיד צריך להיות כלומר באיכות טובה., (איור 5 א ', ב') הטרי וגם מעורבים. תנאי תרבות עניים להשפיע לרעה על הצבירה (איור 5Bi). ספירה מדויקת של תאים להשיג השעיה תא ~ 400 תאים / μl 40 היא חיונית, כמו אגרגטים גדולים נכשלים עצמי לארגן ונוטה יותר ליצור אגרגטים כפולים בתוך כל טוב (איור 5Bii) ואילו אגרגטים קטנים יותר אינם יכולים להגיע לנכון צפיפות בו הם יכולים להגיב לגירוי (איור 5Biii). צעד אופטימיזציה מפתח היה הכללת לשטוף PBS שני שמסיר סרום מזהם מהשעית התא (שלב 2.6); זה שיפר את תדירות הצבירה והאיץ את התפתחות המצרפים של כ 24 שעות. בשלב הבא, שינויים בינוניים להבטיח מיושמים בכוח מספיק כדי לסלק כל אגרגטים שיש לו את הפוטנציאל לדבוק פני השטח של הבאר; כישלון לעשות זאת resuLTS ב'מתרסק 'המצרפים (איור 5Biv). בנוסף, וכפי שהוזכר קודם לכן (ומטה), זה חיוני כדי להבטיח כי המצרפים נשמרים בתרבות השעיה ומנועים מהקפדה על כל משטח. ברגע שהמצרפים דבקים, הדפוס של ביטוי גנים ופוטנציאל התארכותם הם שיבשו.
כטכניקה זו היא פשוטה יחסית, וגם במסגרת גבולות של אנשים עם טכניקות רקמות תרבות טובות, רוב הבעיות הקשורות לצבירה ניתן לפתור במהירות יחסית, אם הם אחרי השלבים הקריטיים אלה; שולחן מלא בעיות ירי נגיש (טבלה 1). ברגע שמשתלט עליו, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור פיתוח צירי, אירועי שבירת סימטריה ותא-החלטה. באופן ספציפי יותר, יש לי אגרגטים אלה הפוטנציאל ליצור בריכות של תאים שהיו זמין עד כה בתרבות, כגון כבל, אופנועים ואופניים השדרהנוירונים r.
הערה אתית: יש לציין בזהירות הראויה שהתרגום של פרוטוקול זה לES אדם או תרבית תאי iPS יכול להביא הניסוי קרוב לבסיס המשפטי של מגבלת ארבע עשרה יום על מחקר בעוברים אנושיים, כלומר הדור של פס פרימיטיווי, כמפורט באדם ההפריה ואמבריולוגיה החוק (2008 בריטניה) 42. מאז החוק מכסה את כל עוברי האדם חיים ללא קשר לאופנם של יצירה, התרבות של gastruloids האנושי מעבר לפרימיטיבי-פס כמו שלב תהיה מעבר להיקף של מחקר רישוי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על פרס חוקר ERC מתקדם לAMA (DAT, שחפת) על ידי עם תרומה של גרנט פרויקט של קרן Wellcome לAMA, מלגת לימודי EPSRC לPB-J וארסמוס, ד"ר Stichting. Vaderlandsch חטיבות של הנדריק מולר וFundatie ואן דה ואן Vrijvrouwe Renswoude 'te S-Gravenhage לSCvdB. אנחנו רוצים להודות לג 'בריסקו, ס מוניוז-Descalzo, ג Schroeter, וט רודריגז, לדיונים וביקורת בונה, חואקין דה Navascués לפרוטוקול ההרכבה הבינוני ושני AK Hadjantonakis וג Budjan לשיתוף הפרוטוקולים של המעבדה שלהם הנוגע להכתמה של עוברים כל הר. גרסה קודמת של מאמר זה היה זמינה בעבר על שרת bioRxiv טרום 29.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | n/a | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10mM in DMSO |
| Dissection Well (30mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 mL GMEM, 5mL Sodium Pyruvate, 5 mL Non-Essential Amino Acids, 5 mL Glutamax, 1 mL beta-mercaptoethanol, 50 mL FBS and 550 µL LIF (1000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | n/a | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux’Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias, ., A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias, ., A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -. K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. . Molecular Embryology of the Mouse. , 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, ., A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- . . Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 – Elizabeth II. , (2008).
