A partir de construcciones de Cristales - Hacia la determinación de la estructura de la β-barril proteínas de membrana externas
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-barril OMPs sólo pueden encontrarse en las membranas externas de las mitocondrias, cloroplastos, y las bacterias Gram-negativas 1-3. Mientras que sirven funciones similares como las proteínas alfa-helicoidal, tienen un pliegue muy diferente que consiste en un dominio de β-barril membrana embebido en el centro que van desde 8-26 ß-hebras antiparalelas con cada filamento está íntimamente conectada a las dos hebras vecinas (Figuras 1 y 2). Los primeros y últimos hilos de dominio β-barril entonces interactúan uno con el otro, casi exclusivamente de una manera anti-paralelo (a excepción de VDAC mitocondrial), para cerrar y sellar el dominio β-barril de la membrana circundante. Todas las OMPs β-barril tienen bucles extracelulares de diferente secuencia y longitud que desempeñan un papel importante en las interacciones de ligando y / o contactos proteína-proteína, con estos bucles a veces ser tan grande como 75 residuos, tales como los encontrados en Neisseria transferrina de unión proUna proteína (TbpA) 4. β-barril OMPs también pueden tener extensiones periplásmicas N-terminales o C-terminales que sirven como dominios adicionales para el propósito funcional de la proteína (por ejemplo, BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Aunque existen muchos tipos de OMPs β-barril 11, dos de los tipos más comunes se describen a continuación como ejemplos para aquellos menos familiarizados con el campo, (1) los transportadores de TonB dependiente y (2) autotransporters.
Transportadores TonB dependientes (por ejemplo, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) son esenciales para la importación de nutrientes y contienen un dominio de enchufe N-terminal que consta de ~ 150 residuos que se encuentra escondido en el interior de un C-terminal de 22 varados-β- barril dominio incrustado en la membrana externa 12 (Figura 3). Mientras que este dominio tapón impide sustrato de pasar libremente a través del dominio de barril, la unión del sustrato induce un cambio conformacional en el dominio de enchufe THpor lo conduce a la formación de poros (ya sea por el enchufe o el reordenamiento por la expulsión parcial / completo del tapón) que luego pueden facilitar el transporte de sustrato a través de la membrana externa en el periplasma. Transportadores de TonB dependientes son especialmente importantes para la supervivencia de algunas cepas patógenas de bacterias Gram-negativas tales como Neisseria meningitidis que se han desarrollado transportadores especializados que secuestran nutrientes como el hierro directamente de proteínas del huésped humanos 4,13,14.
Autotransporters pertenecen al sistema de secreción de tipo V de las bacterias Gram-negativas y son OMP ß-barril que constan de un dominio β-barril (típicamente 12-capítulos como con ESTA y PSA) y un dominio de pasajeros que se secreta o presentados en el superficie de la célula 15,16 (Figura 3). Estas OMPs β-barril sirven a menudo un papel importante en la supervivencia celular y la virulencia con el dominio pasajero servir ya sea como una proteasa, adhesina, y / u otro effector que media la patogénesis.
métodos estructurales, tales como la cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN, y microscopía electrónica (EM) nos permiten determinar los modelos de las OMP en resolución atómica que puede a su vez ser utilizados para descifrar exactamente cómo funcionan dentro de la membrana externa. Esta valiosa información puede entonces ser utilizada para el desarrollo de medicamentos y vacunas, si procede. Por ejemplo, de unión a transferrina de proteína A (TbpA) se encuentra en la superficie de Neisseria y no se requiere para la patogénesis ya que se une directamente transferrina humana y, a continuación extrae e importa el hierro para su propia supervivencia. Sin TbpA, Neisseria no puede secuestrar el hierro del huésped humano y se convierten en no patógenas. Después de la estructura cristalina de la transferrina humana unido a TbpA 4 se resolvió, se hizo mucho más claro cómo asocian las dos proteínas, lo que las regiones de TbpA mediada la interacción, lo que los residuos son importantes para la extracción de hierro por TbpA, ycómo se podría desarrollar terapias contra Neisseria dirigidos TbpA. Por lo tanto, dada la importancia de OMPs β-barril en bacterias Gram-negativas para la supervivencia y la patogénesis, así como en las mitocondrias y la función del cloroplasto, y la necesidad de información estructural adicional sobre esta única clase de proteínas de membrana y los sistemas en los que funcionan , protocolos generales se presentan con el objetivo general de expresar y purificar OMP objetivo en niveles altos para la caracterización por métodos estructurales.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-barril OMP cumplen funciones esenciales en bacterias Gram-negativas, mitocondrias y cloroplastos y son objetivos importantes para el análisis estructural que ofrecen una gran cantidad de información acerca de los mecanismos moleculares esenciales en las membranas externas de estos respectivos orgánulos. Sin embargo, la producción de suficiente muestra para el análisis estructural no siempre es sencillo y por lo tanto, una tubería en general se presenta para la producción de cantidades suficientes de destino OM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
References
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