تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
القدرة على قياس الطفرات الخلايا الجذعية هي أداة قوية لتحديد في عدد السكان خلية بالغ الأهمية إذا، وإلى أي مدى، يمكن أن مادة كيميائية تحفز الطفرات التي تؤدي المحتمل إلى السرطان. استخدام لفحص الأنزيمية لتحديد الطفرات الخلايا الجذعية في العاشر مرتبطة نازعة الجلوكوز 6 فوسفات الجينات ذكرت سابقا. 1 هذا الأسلوب يتطلب إعداد أقسام المجمدة وحضانة الأنسجة مقطوع مع خليط التفاعل التي تعطي اللون الأزرق إذا كانت الخلايا تنتج وظيفية نازعة الجلوكوز 6 فوسفات (G6PD) الانزيم. إن لم يكن، والخلايا تظهر بيضاء. قمنا بتعديل خليط التفاعل باستخدام الأمثل مجمع قطع درجة الحرارة (أكتوبر) المتوسطة بدلا من البولي فينيل الكحول. هذا يسهل قياس درجة الحموضة، ويزيد من ذوبان المكونات تلطيخ G6PD ويحد من انتشار انزيم G6PD و. لإثبات أن طفرة حدثت في الخلايا الجذعية، يجب على سرداب كامل تفتقر G6PD الأنزيميةالنشاط. إلا إذا تؤوي الخلايا الجذعية طفرة G6PD المظهرية وجميع ذرية في سرداب تفتقر G6PD النشاط الأنزيمي. للتعرف على خبايا مع طفرة الخلايا الجذعية، وقطعت أربعة أقسام المجمدة المجاورة متتالية (مستوى) في 7 ميكرون سمك. هذا النهج جعل التخفيضات المجاورة يوفر التشكل التي سرداب وتحور بشكل كامل منذ وسيراعى في نفس سرداب تحور في الفروع المجاورة. وكانت الشرائح مع عينات الأنسجة التي كانت أكثر من 50 ميكرون وبصرف النظر مستعدة لتقييم ما مجموعه> 10 4 الخبايا في الماوس. تردد طفرة هو عدد المرصودة تحور (أبيض) الخبايا ÷ من قبل عدد من النوع البري (الأزرق) الخبايا في مجموعة العلاج.
Introduction
ويعتقد أن سرطان القولون لإشراك التعرض للعوامل البيئية والمكونات الغذائية التي يمكن أن تضر الحمض النووي وإنتاج تفعيل الطفرات الجسدية في الجينات المسرطنة (مثل ß-catenin) أو تعطيل الطفرات في جينات الورم القامع (على سبيل المثال، APC). ومن المفترض أن هذه الطفرات الهامة تحدث في الخلايا الجذعية القولون. بسبب بنية فريدة من سرداب ظهارة القولون، فمن الممكن لقياس الطفرات الخلايا الجذعية في القولون بعد تعريض الحيوانات للمواد الكيميائية المرتبطة القولون التسرطن. كما أن الكثير من الانزيمات المرتبطة X بمثابة مؤشرات لالطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية، حيث أن الطفرات سوف تكون موجودة في جميع الخلايا داخل سرداب.
سابقا، وقد نشرت إجراء يدل على أن المواد الكيميائية التي تحفز على أورام القولون في الفئران ولدت أيضا جسدية الطفرات الخلايا الجذعية في القولون عن طريق تحليل الطفرات في نسبة الجلوكوز 6 فوسفات نازعة المرتبطة X (G6PD) الجين 1-3طريقة الكمي حدوث الطفرات الجسدية العشوائية في الخلايا الجذعية القولون دون أي ضغط الاختيار. الإجراء ينطوي على إنتاج غير المثبتة أقسام القولون المجمدة من الفئران التي عولجت والسيطرة والتعرف على الخبايا خالية من الخلايا التي تنتج النشاط G6PD وظيفية. هذه الخبايا تحور، والتي تظهر أبيض، تشير إلى أن التحور حدث في الخلايا الجذعية التي أدت إلى النسل أيضا بإيواء جين G6PD تحور. في فحص الأنزيمية، ويمكن G6PD الخبايا متحولة ناقصة لا أكسدة الجلوكوز 6 فوسفات، وهو مطلوب للحد من نتروبلو الأزرق نيترو (NBT). عندما انزيم G6PD هو وظيفي، ويتم تقليل NBT في خليط تلطيخ لformazan غير قابلة للذوبان والرواسب، وتراكم في موقع الإنزيم و "تلطيخ" الخلايا الزرقاء. الخلايا التي هي المسوخ G6PD تبقى بيضاء على النقيض من الأزرق الملون الخبايا نوع البرية. يقيس هذا الأسلوب الطفرات التي لديها "لاغيا" النمط الظاهري. لأن ENإنزيمات، مثل G6PD، يمكن نزع فتيل خارج الخلايا على قسم الأنسجة غير المثبتة إذا وضعت المقاطع في محلول مائي، فمن الضروري لتحقيق الاستقرار في الانزيم في أقسام الأنسجة لتحليلها. 4 إن استقرار الانزيم في الأنسجة يجب ألا تتداخل مع انتشار جزيئات صغيرة كاشف اللازمة للتفاعل G6PD الأنزيمية.
لقد قدمت عددا من التغييرات الهامة لإجراء الأصلي. تم تغيير وسيلة لتلطيخ الأنزيمية حاسم من البولي فينيل الكحول لالأمثل قطع درجة الحرارة مجمع (أكتوبر)، مما يسهل السيطرة درجة الحموضة والإذابة من المكونات المستخدمة في الفحص. يتم تنفيذ تلطيخ باستخدام 0،4-0،5 مل الآبار مصنوعة من الفولاذ المقاوم للغسالات بحيث حصل كل قسم الأنسجة نفس الحجم من خليط التفاعل G6PD. وقد تم وضع إجراءات لتقدير عدد من الخبايا في قسم تصوير توفر عينة كبيرة من انسجة القولون دون الحاجةالعد يدويا> 10 5 الخبايا لكل القولون. تحليل المجاورة 7 ميكرون أقسام الأنسجة يتيح التصور من سرداب متحولة على أكثر من شريحة واحدة، مما يقلل من التحف تلطيخ المحتملة. هذه التغييرات تجعل الإجراء أكثر كفاءة واستنساخه.
باستخدام هذا البروتوكول المعدل، لقد كميا وتيرة الطفرة في الخلايا الجذعية القولون بعد تعرض C57BL / 6 الفئران لazoxymethane، وهي مادة مسرطنة القولون المعروفة في القوارض. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
غالبا ما يتم تحديد تأثير السمية للمركب بقدرته على تعديل الحمض النووي. ويتم ذلك عادة من خلال عزل الأنسجة وقياس مستوى عالمي من الحمض النووي adducts. لAOM، وهذا ينطوي على قياس O 6 -methylguanine adducts في القولون. باستخدام هذه المعلومات النهج على الضرر في غضون أنواع معينة من الخلا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس لديهم الاعترافات.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
