Summary

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Published: November 10, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

Im Gehirn, die meisten der Gefäßsystem besteht aus einem selektiven Schranke, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Austausch von Molekülen und Immunzellen zwischen dem Gehirn und dem Blut reguliert. Darüber hinaus erfordert die große neuronale metabolischen Bedarf einen Moment zu Moment Regulation des Blutflusses. Bemerkenswert ist, Anomalien dieser Regelungen sind ätiologische Markenzeichen der meisten Hirnerkrankungen; einschließlich Glioblastom, Schlaganfall, Ödeme, Epilepsie, degenerative Erkrankungen (Beispiel: Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit), Hirntumoren sowie entzündlichen Erkrankungen, wie Multiple Sklerose, Meningitis und Sepsis-induzierten Hirnfunktionsstörungen. So, das Verständnis der Signalwege Modulation der zerebrovaskulären Physiologie ist eine große Herausforderung. Viel Einblick in die zellulären und molekularen Eigenschaften der verschiedenen Zelltypen, die den zerebrovaskulären System besteht aus einer Primärkultur oder Zellsortierung von frisch gewonnenen Hirngewebe gewonnen werden. Jedoch,Eigenschaften wie die Zellpolarität, Morphologie und inter Beziehungen nicht in solchen Zubereitungen gehalten. Das Protokoll, das wir beschreiben soll Hirngefäß-Fragmente zu reinigen, während die strukturelle Integrität. Wir zeigen, dass isolierte Gefäße bestehen aus Endothelzellen durch Tight Junctions, die durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben sind versiegelt. Perizyten bleiben glatten Muskelzellen sowie die perivaskuläre Astrozyten Endfüßen Membranen Endothelschicht befestigt. Schließlich beschreiben wir, wie Immunfärbung Experimente an gereinigt Hirngefäße durchzuführen.

Introduction

Die einwandfreie Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS) erfordert einen stark regulierten extrazellulären Umgebung, und seine metabolischen Anforderungen sind riesig im Vergleich zu anderen Organen 1. Das ZNS ist auch extrem empfindlich gegenüber einer Vielzahl von Chemikalien, in der Regel unschädlich für periphere Organe, sondern sie neurotoxische. Um eine einwandfreie Funktion zu gewährleisten, bildet der größte Teil der CNS 'Gefäßsystem eine Endothelbarriere; die Blut-Hirn-Schranke (BBB), die den Fluss der Moleküle und Ionen sowie die Passage von Immunzellen, die zwischen dem Blut und dem Gehirn steuert, wodurch die richtige Homöostase 2 beibehalten, sondern auch die Eingabe von therapeutischen Arzneimitteln einschränkende Weise behindern Behandlungen neurologische Störungen 3. Auf zellulärer Ebene ist die BBB hauptsächlich durch umfangreiche tight junctions zwischen Endothelzellen, polarisierte Expression von Efflux-Transporter und einem sehr niedrigen Transzytose Rate 4 aufrechterhalten. Eigenschaften und Funktionen der BBB sind meist von ne induzierteighboring Zellen 4. Insbesondere spielen Perizyten eine wichtige Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des BBB 5,6. Als kontraktilen Zellen Perizyten, regulieren auch die Durchblutung 7 als die glatten Muskelzellen umgebenden großen Gefäßen zu tun. Schließlich Astrozyten, die großen gliale Zellen des Gehirns, zu senden große Prozesse Endfüßen herum gestattet meisten Gehirngefäß 8 und modulieren BBB Integrität und Immun quiescence 9, den Transfer von Stoffwechselprodukten der Neuronen 10 und induzieren die enge Kopplung von neuronaler Aktivität und Blutung 11,12.

Die Fähigkeit, die molekularen und zellulären Eigenschaften des zerebrovaskulären Systems zu studieren, ist entscheidend, um eine bessere Charakterisierung ihres Beitrags zur Gehirnphysiologie und Arzneimitteltherapie. Um diese Frage anzugehen, Strategien, um das Gehirn die zerebrovaskuläre System zu isolieren sind entwickelt worden, die für die Herstellung von intakten Gehirn Schiffes Fragmente zu ermöglichen. Hirngefäßes purification wurde anfänglich unter Verwendung von Rinder Gehirne 13 beschrieben und verbessert und an andere Spezies, insbesondere Nagetieren 14. In dieser letzten Untersuchung wurde die Verwendung von Filtern unterschiedlicher Größe eingebracht, um den Hirngefäßen in den Fraktionen in Gefäße unterschiedlicher Durchmesser angereichert trennen. Interessant ist, dass in solchen Zubereitungen, hielt Endothelzellen ihren metabolischen Eigenschaften 15, Transporter Funktionen 16 und 17 Polarisations. Hier beschreiben wir im Detail dieses Protokoll und weiter zu zeigen, dass isolierte Gefäße behalten die meisten ihrer in situ-Strukturen. Endothelzellen bleiben tight junctions verbunden und durch eine kontinuierliche Basallamina umgeben. Perizyten und Zellen der glatten Muskulatur bleiben der Endothelschicht sowie perivaskuläre Astrozyten Membranen angebracht. Jedoch Astrozyten Mikroglia-Zellen, Neuronen und Oligodendrozyten eliminiert. Schließlich beschreiben wir ein Verfahren durchzuführen Immunfärbung auf isolierte Hirngefäße. </p>

Bis jetzt die meisten der molekularen und zellulären Untersuchungen zur zerebrovaskulären Systems haben auf gereinigt Hirngefäßzellen durch distanzierte geführt Zellsortierung unter Verwendung von zellspezifischen Reportermausstämmen oder Immunfärbung basierte Verfahren 18,19. Obwohl diese Techniken können zur Isolierung von fast reinem zerebrovaskulären Zellpopulationen, isolierte Zellen vollständig verlieren ihre in situ Morphologie und Wechselwirkungen, die wiederum stark ihre molekularen und zellulären Eigenschaften betrifft. Das hier beschriebene Protokoll, so dass für die Isolierung von Gesamt zerebrovaskulären Fragmente ohne Notwendigkeit von spezifischen Antikörpern oder transgene Maus Flecken, bietet eine gute Alternative, da die Gesamtstruktur der isolierten Hirngefäße konserviert somit Verminderung Auswirkungen auf ihre molekularen Eigenschaften. Isolated Schiffe könnten dann für die Untersuchung der Genaktivität, Proteinsynthese und Regulierung an der BBB verwendet werden, wie kürzlich beschrieben 20,21 </sup>. Schließlich, im Vergleich zu Laser Mikrodissektion 22,23 Dieses Protokoll ist kostengünstig, einfach durchzuführen und in jedem Labor schnell anpassungsfähig.

Protocol

1. Lösungen und Materialien Bereiten Isolationsgefäß Lösungen: B1, fügen Sie 1,5 ml HEPES 1M zu 150 ml HBSS; B2, fügen 3,6 g Dextran zu 20 ml B1; B3, wird 1 g BSA in 100 ml B1. Ändern Sie den Filterhalter durch das Schneiden des Boden off der oberen Verschraubung Teil. Bereiten Immunfärbung Lösungen: Fixierungslösung, 4% Paraformaldehyd in PBS pH 7,4; Permeabilisierung / Blockierlösung, verdünnter Ziegenserum zu 5% und Triton X100 auf 0,25% in PBS pH-Wert 7,4. Anmerkung:…

Representative Results

Hier haben wir ein Protokoll, so dass für die mechanische Isolierung des Hirngefäße 14 zu beschreiben. Abbildung 1 fasst die wichtigsten Schritte dieser Technik. Die Architektur der Hirngefäße ist komplex und umfasst mehrere Zelltypen, dh, Endothelzellen von tight junctions verschlossen und von Perizyten, glatte Muskelzellen und Astrozyten Fußfortsätzen 9 umgeben. So nach der Isolierung der Gehirngefäße, war es unser Ziel, die Struktur des gereinigten Gefäße dur…

Discussion

Die Blut-Hirn-Schranke regelt den Durchgang von physiologischen Substanzen in und aus dem ZNS und schützt sie vor im Blut vorhandenen möglicherweise schädlichen Substanzen. Es wird in verschiedenen ZNS-Erkrankungen beteiligt, darunter neurodegenerative Erkrankungen 2 und Hirntumoren 28. Der extrem niedrige Durchlässigkeit des BBB behindert auch den Durchgang von Therapeutika gezielt Nervenzellen und die Entwicklung von Methoden der Absicht, reversibel öffnen Sie die BBB ohne nachteilige Folgen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Labex MemoLife und durch die ARSEP unterstützt (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en Plaques)

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000

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Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).

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