Summary

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

Published: September 30, 2015
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Summary

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

Abstract

망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에​​ 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다.

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.

Introduction

망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다.

OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다.

화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다.

이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.

Protocol

이 프로토콜은 "비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 권장 사항에 따라 수행된다. 1. 계란 취급과 눈 모음 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다. 참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이?…

Representative Results

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다. 전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵…

Discussion

이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과.

전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

Materials

1xPBS (tablet) Life technologies 18912-014
10xDPBS Life technologies 14080-048
100 mm Petri dish VWR 734-0006
100 μL pipette tips VWR 613-0798
1.5 mL disposable plastic cuvette Thomas Scientific 8495V01
24-well plate Sigma Aldrich D7039
35 mm Petri dish VWR 391-1998
70% ethanol Solveco 1054
Cdk1/2 inhibitor III 217714 Calbiochem 300nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator Thermo Forma
Dissecting microscope Leica
DMEM Life Technologies 41966-029
Electrodes Platina, custom made
Electro square porator ECM 830 Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix Life Technologies 31331-028
FBS Life Technologies 16140-071
Forceps AgnThos 0108-5-PS
Freezing medium NEG50 Cellab, Sweden 6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany 8204
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
L-glutamine Life Technologies 25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI Life Technologies P36935
Paraffin film VWR 291-1214P
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold  Sigma Aldrich E6032
Penicillin streptomycin Life Technologies 15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)  Millipore 06-570 Dilution 1/4000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles") Sargenta 390-R (rondeller) Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes  Sonidel CUY700P4L Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette VWR 612-2853
Rotator shaker VWR 444-2900
Small spoon VWR 231-2151
Sucrose VWR 443815S
White Leghorn eggs Local supplier
Wine cooler WineMaster 24, Caso, Berlin Germany

References

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Cite This Article
Shirazi Fard, S., Blixt, M., Hallböök, F. Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments. J. Vis. Exp. (103), e53202, doi:10.3791/53202 (2015).

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