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Developmental Biology

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Published: November 30, 2015
doi:
10.3791/53183
, , ,
1Program in Genetics & Genome Biology,The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics,The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation,Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology,University of Michigan

Summary

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Abstract

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Introduction

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.

To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.

We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

Protocol

1. Herstellung von Agar Injection Plates (Dauer: 45 min) Kochen Sie 2% bis 3% Agarose in E3 Medien und ermöglichen Lösung leicht auf der Bank zu kühlen. Anmerkung: Die Anzahl der Einspritzplatten vorbereitet bestimmt die Menge an Agarose erforderlich. Jedes Injektionsplatte muss ca. 35 ml der Agarose-Lösung. Nach dem Auskochen die Agarose zu kühlen, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist (z. B. 45 ° C) nach der Spritzgießform Herstellers. Gib ca. 35 ml der Agarose in einen 100-mm-Schale abgekühlt. Platzieren Sie ein Ende der bevorzugten Spritzgussform in Lösung, dann lag Rest der Form auf Agarose-Lösung (dies wird dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen). Damit die Agarose-Lösung entweder bei RT oder bei 4 ° C für ca. 30 min verfestigt. Verwenden Sie einen Spachtel, um ein Ende der Form aus dem festen Agarose zu trennen. Entfernen Sie langsam den Rest des m alt. 2. Herstellung von Evans Blue-Farbstoff (EBD) Injection Mix (Dauer: 30 min) Einen 1% Vorrat an EBD in 1X Ringerlösung (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl 2; 1 mM MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose; pH 7,2), welches bei RT gelagert werden können. Machen Sie eine Stammlösung von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Dextran MW 10.000 kDa bei 25 mg / ml in 1X Ringer-Lösung und bei -20 ° C Bereiten Injektionsmischung durch Verdünnen EBD auf 0,1% direkt im Stammlösung von FITC-Dextran Lager (dh für eine endgültige Arbeitsvolumen von 100 & mgr; l. Mischen Sie 10 ul 1% EBD in 90 & mgr; l FITC-Dextran Lager). Gründlich Wirbelinjektions Mix (es sollte grün) und vor direktem Licht zu halten durch Umwickeln Injektionsmischrohr mit Aluminiumfolie. 3. EBD Injektionspräparat (Dauer: ca. 30 min) ent "> Hinweis: Protokoll funktioniert am besten mit Larven aus 3-7 Tage nach der Befruchtung (DPF). Pre-warmen Einspritzplatte auf RT. Einrichten Einspritzvorrichtung durch Anordnen von Mikromanipulator auf Metallplatte und stehen neben dem Mikroskop wird zur Injektion verwendet. Schalten Sie Luft angetrieben Mikroinjektion Controller. Hinweis: Die bevorzugte Injektionssystem wird von Labor variieren und sollte Ergebnis der Analyse nicht ändern. Zurück zu füllen Injektionsnadel mit rund 2-4 ul der EBD-Mix. Kalibrieren Injektionsvolumen etwa 5 nl der EBD-Mix. Hinweis: Injektionsvolumen Kalibrierung wird am Kalibrierungsverfahren abhängen. Ein Kolben angetrieben Injektion kann direkt an einen bestimmten Einspritzmenge eingestellt werden, wohingegen Gasdruck-Injektoren die Einspritzmenge über Volumen-Bolus mit dem Einsatz von einem Mikrometer kalibriert benötigen. Wet Spritz Platte mit 1X Ringer-Lösung und entfernen Sie überschüssiges aus Brunnen. Pre-Treat-Larven, die mit 0,04% Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat salt (Tricaine) in 1X Ringerlösung Larven vor dem Beginn der Einspritzung zu immobilisieren verdünnt. Hinweis: Die Gewährleistung der Larven sind komplett unbeweglich ist wichtig, da die Injektions ist schwierig mit jeder Restbewegung. Zeigen anästhesiert Larven in die Vertiefungen der Agar-Einspritzplatten unter Verwendung einer Glaspipette. Stellen Sie sicher, dass die Larven sind vollständig in den Brunnen und auf ihrer Seite liegen. Anmerkung: Die Zahl der Larven pro Vertiefung bis zu den Experimentator. Nach Larven werden in den Vertiefungen setzen, entfernen Sie überschüssige Ringer-Lösung, um Larven Bewegung innerhalb der gut zu minimieren. Lassen Sie eine Restmenge an Lösung, so dass Larven nicht zu dehydrieren. 4. Pericardial Injektion von Zebrafisch-Larven mit EBD (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende, schätzungsweise 1-3 h) Legen Sie die Einspritzplatte, die die Larven auf einem Binokular, wo die Injektionen durchgeführt. Positionieren Sie die Injektionspipette Nadel enthält,die EBD-Mix über einen Zebrafisch-Larven. Re-Position der Einspritzplatte durch Drehen, so dass die Injektionsnadel in der Nähe Herzen der Larven und etwa 45 ° ventral von der Vorwärts-Rückwärts-Achse. Einfügen der Injektionsnadel in die gemeinsame Cardinalvene (CCV) im Bereich der Vene am vorderen Teil des Eigelbs, wo die Ader wird zunächst Drehen in dorsaler Richtung (Figur 1). Hinweis: Eine Vergrößerung von bis zu 40x kann nützlich sein, deutlich sehen, die CCV sein. Injizieren Sie 5 nl der EBD-Mix und halten Injektionsnadel in Position für 5-8 Sekunden, um sofortige Leckage von EBD-Mix zu minimieren. Anmerkung: Eine gute Einspritzung Farbstofffärbung in den Herzkammern gesehen (Figur 1) aufweisen. Wenn EBD Mischung nicht im Herz beobachtet, dann Einspritzen einer zusätzlichen 5 nl des EBD Mischung kann ausreichen, um die Farbstoffaufnahme induzieren. Alternativ kann die Embryos verworfen. Hinweis: In einigen Situationen kann der Herzschlag zu stoppen. Wenn diese occurs, weiterhin die Larven für 20-40 sec überwachen. In der Regel nimmt der Herzschlag, wie der Farbstoff durch das Kreislaufsystem bewegt. Gehen Sie zum nächsten Larven und wiederholen. Identifizierung erfolgreich injizierten Embryonen durch Beobachten der Gegenwart von FITC-Dextran in die Vaskulatur unmittelbar nach der Injektion (Figur 2). 5. Inkubation und EBD Aufnahme (Time: 4-6 h) Nachdem die gewünschte Anzahl von Larven injiziert Rück injiziert Larven auf 1X Ringerlösung ohne Tricaine in 100 mm-Schalen. Halten Sie Speisen in Aluminiumfolie eingewickelt. Hinweis: Halten Sie injizierten Larven in der Dunkelheit deutlich erhöht Überlebensraten und gewährleistet die größte Konsistenz in der Signalstärke. Wickel in Aluminiumfolie ist besonders wichtig für die Zeitspanne, die die Larven sich außerhalb des Inkubators. Erlauben Larven bei 28,5 ° C für 4-6 Stunden inkubiert, um eine ausreichende EBD Aufnahme zu gewährleisten. </ol> 6. Visualisierung der EBD im Muskel (Time: Abhängig von der Anzahl der Larven injizierende und Art der Mikroskopie, geschätzte 0,5 bis 3 h) Vor der Bilderzeugung, betäuben die Larven mit 0,04% Tricaine um Bewegung zu verhindern. Ansicht Larven unter rote Fluoreszenz zu bestimmen, ob EBD-Aufnahme in Skelettmuskel (3) auftritt.

Representative Results

Die EBD Injektion Mischung wurde bei 3 dpf in die CCV von sapje homozygote Mutanten und Wildtyp-Geschwister injiziert. Injektionen, die den Herzkammern (1B) gefüllt wurden dann für eine erfolgreiche Injektion durch die Visualisierung von FITC-Dextran in die Vaskulatur unter grüne Fluoreszenz (Figur 2) untersucht. Nach 4 Stunden Inkubationszeit wurde EBD Aufnahme an der Somitenstufe mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Wildtypgeschwister zeigte keine EBD Fluoreszenz innerhalb sichtbare Muskelfasern (3A), wohingegen die sapje homozygoten Mutanten zeigten EBD Aufnahme, was Schäden an der Muskelmembran 15 (3B). Abbildung 1. Spritzen EBD Injektion Mischung in den gemeinsamen Kardinal Vene (CCV) eines Zebrafisch embryo. (A) nicht-injizierten Embryo. Pfeil zeigt den idealen Standort für CCV Injektion. (B) Erfolgreiche Injektion in den CCV. Der Farbstoff dringt in die Herzkammern (Pfeil) und beginnt, durch das Gefäßsystem gepumpt werden. (C) Ein erfolgloser CCV Injektion wird in einigen oder allen der Farbstoff Eingabe der Dottersack des Embryos (Pfeil) zur Folge haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2. Die Embryos können für eine erfolgreiche Injektion durch Beobachtung FITC-Dextran Verteilung unter grüne Fluoreszenz im gesamten Gefäßsystem unmittelbar nach der Injektion und vor der EBD Aufnahme sortiert werden.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: EBD wird durch Fasern mit beschädigten Membranen (A) Wildtyp Geschwistern zeigt keine EBD Fluoreszenz in Muskelfasern entnommen werden.. (B) Sapje ​​homozygote Mutante mit EBD Fluoreszenz in mehreren Muskelfasern (Pfeile). Alle Larven wurden mit dem EBD Injektions Mischung injiziert und nach 4 h Inkubation bei 3 dpf analysiert. Geschwister und Mutanten wurden durch Muskelfaserablösung vor dem CCV Injektions sortiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Zebrafisch als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der neuromuskulären Erkrankungen 2,29 Schwellen. Bis heute hat der Zebrafisch-System verwendet worden, um neue Muskel krankheitsverursachende Mutationen 16,17,30 validieren, aufzuklären neue Pathomechanismen 18 und identifizieren potenziell neue Therapeutika 12,24. Diese gemeinsamen Anstrengungen haben den Nutzen der Zebrafisch die menschliche neuromuskuläre Krankheiten Modell etabliert. Doch trotz der Fortschritte mit Zebrafischen und Säugetieren Modellen, gibt es begrenzte Behandlungsmöglichkeiten für Patienten in das breite Spektrum der neuromuskulärer Krankheiten. Daher besteht eine hohe Nachfrage nach Therapieentwicklung für diese Gruppe von verheerenden Krankheiten. Parallel zu dieser Nachfrage nach Therapeutika ist die entsprechende Notwendigkeit einer laufenden experimentellen Innovationen sowie rigorose Analyse, neue Tiermodelle und vermeintlichen therapeutischen Strategien zu überprüfen.

EBD-Analyse wird häufig in Maus-Modellen verwendetStudie Gewebe und Zellschäden im Gehirn, Herz und Skelettmuskel 27,31. Am auffälligsten ist, EBD ausgiebig in Mausmodellen von verschiedenen Muskeldystrophie Subtypen verwendet werden, um den Schweregrad der Muskelmembran Instabilität zeigen und 8 beschädigen. Die Verwendung von EBD, um Muskelmembranschäden aufzudecken ist eine unterstützende Parameter Gründung Ähnlichkeiten des Tiermodell für das menschliche Krankheitszustand 9. Die Macht der EBD in Maus hat mehrere Labors, einschließlich unserer eigenen führte, zu entwickeln und anzuwenden, um EBD Zebrafisch Modelle von neuromuskulären Erkrankungen. Aufgrund der Anwendbarkeit der EBD-Analyse wird diese Technik aktiv umgesetzt, um Zebrafisch-Modelle auf den menschlichen Krankheitszustand 11,15,22,24,32 mauern. Larven mit beschädigten Muskelmembranen müssen EBD-Aufnahme und damit rote Fluoreszenz in Muskelfasern. Fluoreszenz in dem Raum zwischen den Fasern beobachtet, jedoch nicht im einzelnen Muskelfasern kann auch informative Faser Ablösen von der Basalmembran in t seiner Abwesenheit von Membranschäden, die nützliche diagnostische Details. EBD-Analyse hat mögliche Anwendung außerhalb Tiermodellvalidierung. Die Bemühungen von unserem Labor haben kürzlich gezeigt, dass EBD-Analyse ist von Vorteil bei der Validierung potenziell neuartigen Therapien 24. Feststellung, ob potenzielle therapeutische Behandlungen reduzieren oder abzuschaffen EBD-Aufnahme in neuromuskuläre Erkrankung Modelle können relevante therapeutische Wirkung 8 bedeuten. Diese Art der Analyse kann helfen, die Mechanismus (n) von Therapeutika und dehnt die Anwendung der EBD-Analyse.

Wie bei vielen Techniken, hat EBD Analysen haben mehrere Einschränkungen, die während experimentellen Design und Praxis eingehalten werden. Zum Beispiel kann es schwierig sein, die CCV identifizieren aufgrund der Verdickung des Gewebes mit dem Alter. Zusätzlich ist es einfach zu Larven in Vorbereitung beschädigen vor und während des perikardialen Injektion Reduktions experimentellen Zählungen und erhöhen den Bedarf an einer großen Anzahl von Larven prep.Außerdem können mechanische Schäden die Larven während der Handhabung und Einspritzung erfolgen in false positives Ergebnis als beschädigt Muskel aufnehmen kann EBD. Um einige dieser Hindernisse zu überwinden, haben wir ein Co-Einspritzstrategie in diesem Video-Artikel, der eine einfache und zuverlässige Identifikation von Larven mit sofort erfolgreich Farbstoff Infusion nach der Injektion und vor der anschließenden Analyse erlaubt beschrieben. Die FITC-Dextran Coinjektion Steuerungen für erfolgreiche Injektion indem Bestätigung EBD im Gefäßsystem vor der Aufnahme durch die Muskelfasern. Dies kann besonders nützlich sein, da EBD Fluoreszenz wird nach mehreren Stunden, wenn nicht in den Muskelfasern gesammelt stark diffuse in Larven; Als solches ist es schwierig zu erkennen sein. Darüber hinaus fehlt der CCV und Injizieren EBD in den Dotter oder Körperhöhle kann nach der Inkubation ergeben diffuse rote Fluoreszenz ähnlich Embryonen zu steuern, noch mit der verringerten Wahrscheinlichkeit der Aufnahme durch beschädigte Muskelfasern. Gemeinsam sind diese Höhlenats vorschlagen EBD Injektion erfordert Geduld und Praxis, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.

In all beschreiben wir eine praktische und einfache Methode, um EBD-Analyse auf Zebrafisch-Larven durchzuführen. Bisher hat sich die Verwendung von Zebrafisch als Modellsystem, vor allem als Mensch Krankheitsmodell, wurde schnell wachsenden. Diese Expansion ist zum Teil auf die weitere Entwicklung und Veränderung der experimentellen Techniken, die auf den gegenwärtigen Vorteile der Zebrafisch-System zu verbessern. Die EBD Injektionstechnik stellt eine zusätzliche und leistungsfähiges Werkzeug, um eines Forschers Arsenal für die Validierung und Untersuchung der Zebrafisch Muskelkrankheitsmodellen. Die laufende Umsetzung und Änderung dieser Technik hat das Potenzial, zu helfen aufzudecken neuer Therapiestrategien sowie krankheitsverursachenden Mechanismen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Trent Waugh für seine technische Unterstützung danken. Wir die Abteilung für Pädiatrie an der Klinik erkennen auch für kranke Kinder und Cure kongenitaler Muskeldystrophie (CMD) für die großzügige Finanzierung für dieses Projekt.

Materials

Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 Sigma FD10S
Evan's Blue Dye Sigma E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma A5040
100 mm Petri dish Fischerbrand FB0875712 Injection mold base
Thin wall glass capillaries World Precision Instruments TW100F-4 For Injection needle
Agarose Bioshop AGA001 Injection mold
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 Injection mold
Sodium chloride Bioshop SOD001 Ringer's solution
Potassium chloride Bioshop POC888 Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate Sigma M2670 Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Ringer's solution
HEPES Sigma H4034 Ringer's solution
Glucose BioBasic GB0219 Ringer's solution
Calcium chloride Sigma C1061 Ringer's solution
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References

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Smith, S. J., Horstick, E. J., Davidson, A. E., Dowling, J. Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye. J. Vis. Exp. (105), e53183, doi:10.3791/53183 (2015).
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