JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em> Drosophila</em> Embriyolar

Published: September 10, 2015
doi:
10.3791/52985
, , , ,
1University of Clermont-Ferrand, 2Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

Abstract

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

Introduction

Hücreler gelişme sırasında, belirli özellikleri nasıl edindikleri anlama organlarının karmaşıklığı ve patolojik durumların karşı potansiyel evrim takdir etmek için çok önemlidir. Sonuç vermediği genel gen ekspresyon profillerinin hücre özellikleri ve farklılaşmasını altında yatan gen düzenleme ağları deşifre büyük araştırma itekleme mevcuttur, Pol II bağlama durumu, düzenleyici diziler ya da histon post-translasyonel modifikasyonlar transkripsiyon faktörü doluluk.

Küresel düzeyde mikrodiziler gen ifadesini değerlendirmek için ve RNA-seq yaklaşımlar kullanılmaktadır. Mikrodiziler RNA seq kodlama dahil mikroRNAlar lncRNAs veya snRNAs gibi RNA'lar kodlamayan RNA'ların farklı türlerde bilgilendirme daha dişli ise, mRNA bolluk algılamasını sağlar. Ancak, bu teknikler aktif-transkripsiyonu ayırt edemez, kararlı hal mRNA, mRNA'nın aktif-çeviri ve mRNA yıkımı sürecinin girerek. Kararlı st ÖlçmemRNA düzeylerini yedi proteome bileşimin 1-3 kötü bir tahmin olarak bilinmektedir. Aksine olarak, mRNA'nın etkin-çeviri tespit protein üretiminin daha doğru bir görüntü sağlar.

Bununla birlikte, transkriptomik çalışmaları, asıl olarak doğal tipte bir durumda 07/04 ya da parçalara doku kazancı ya da belirli bir faktör fonksiyon kaybı karşılaştırarak yorumlama geni ekspresyonunun zorlaştırarak tüm organizma seviyesinde neden olmuştur. Hücre hedef araçları, afinite saflaştırma ve hassasiyet gelişmeler son gelişmeler genom çapında canlı bir organizmada, küçük hücre popülasyonlarının ya da hatta tek hücreler üzerinde analiz gerçekleştirmek için izin verir.

Drosophila, transgenik hatlarının büyük koleksiyonları hücre fonksiyonu için gerekli olan moleküler mekanizmaların daha doğru kantifikasyon verimli GAL4 / UAS sistemi 8-10 aracılığıyla farklı doku ve hücre alt spesifik zamansal ve mekansal hedefleme sağlar.

<p clYeni geliştirilen yaklaşımlar arasında kıç = "jove_content"> fraksiyonasyon ile profil RNA 11 aktif-çeviri yakalamak için bir yol olarak tarif edilmiştir polisom. Sukroz gradyanlı santrifüjleme temeline dayanan bu yöntem mikrodiziler veya derin dizilemesi ile analiz edildiğinde polisom fraksiyonu ve mRNA tespiti seçimi tüm genom çevrilmiştir sağlar. Polizom yalıtım için işlemi sırasında 12 ribozomlar tarafından korunan RNA fragmanları mukabil ribozomal ayak izleri tespit etmek nükleaz sindiriminden ile akuple edilebilir. Ribozomal footprinting RNA çeviri ve RNA dizisi düzey çözünürlük ve ribozom konumlandırma miktarının doğruluğu, çeviri hızını ölçmek mümkün kılar artar. Bununla birlikte, esas olarak ribozom ayak izi işleminin sonunda elde edilen RNA verimle güçlü bir azalmaya, translatomes arasında hücreye özel izolasyon uygulanmamıştır bugüne kadar. RNA boyutu seçimi potansiyel yalancı p oluşturabilir göz önüne alındığındaAyrıca, benzer bir şekilde, RNA koruma olabilir, farklı RNP gelen ositives, daha fazla geliştirme ribozomal ayak izi artırmak ve hücreye özel yaklaşımlara uyarlamak için ihtiyaç vardır.

Bu yöntemlerden biri, Tercüme ribozom Affinity saflaştırma (TRAP) Heiman ve arkadaşları tarafından, 2008 de tarif edilmiştir olarak adlandırılan. ve farelerde nöronların bir alt gruptan alınan translatome izole etmek için uygulanan. Tarafından, bir hücre türüne özgü bir şekilde, bir ribozomal protein epitopa etiketleme, polisomlann seçici hücre ayrılma ve sıralama zahmetli aşaması olmaksızın saflaştırılabilir. Bu durumda, ribozom yüzeyinde 60S ribozomal protein L10a eGFP 13 ile etiketlendi. 2008 yılından bu yana, çeşitli çalışmalar X'te 14-19 farelerin, farklı türlerde bu yöntemi kullanmış 24 thaliana 20,21, 22,23 ve zebra balığı Arabidopsis laevis. TRAP yöntemi de Drosophila modeli uyarlanmıştır ve arındırma için kullanılmıştırfy hücre türüne özgü nöronal hücrelerin 25 ve astrositlerden 26 den mRNA. Yönlü, ikili GAL4 / UAS sistemi, bir doku-spesifik bir şekilde GFP-etiketli RpL10A ifade etmek için kullanılmıştır. Yetişkin sineklerin Başkanları dizildi (pan-nöral Elav-Gal4 sürücüsü tarafından hedeflenen) nöronal hücrelerin ve izole RNA'lar gelen Polizom seçimini gerçekleştirmek için disseke edildi. Yukarı regüle genlerin sayıda Drosophila embriyolar geliştirilmesinde (az 1 hücrelerinin% 'si), bu yaklaşım, iyi bir spesifisiteye belirten ve seyrek hücre popülasyonlarına adapte bize isteyen, sinir sisteminde eksprese edildiği bilinen karşılık gelen .

Moleküler aktörler ve morfogenetik hareketler evrimsel korunmuş olarak Drosophila modeli içinde, embriyonik aşama, gelişim süreçleri çalışma için seçim modelidir. Bu modelde, şimdiye kadar yapılan, sadece doku spesifik transkriptomik yaklaşımlar, böylece hücre ya da nükleer kullanılarak gerçekleştirilmiştirrting ve sadece sinek embriyo doku / hücre spesifik translatome profilleme adanmış yöntemlere ihtiyaç yaratarak, kararlı durum transcriptome 27-31 incelemek mümkün olmuştur. Burada Drosophila embriyolar adanmış ilk TRAP protokolü sunduk. Bu yöntem ile, devreye-için mRNA embriyo başına yaklaşık 100 kas hücrelerinin çok kısıtlı bir hücre popülasyonunda başarılı bir şekilde yüksek kalitede ve özgüllük ile izole edilmiştir. İkili GAL4 / UAS sistemi herhangi bir toksisite olmaksızın kasların alt popülasyonunda GFP etiketli RpL10A ifadesini sürmek için kullanılan, hiçbir belirgin fenotipleri veya gelişimsel gecikme önce gösterildiği gibi 25. Drosophila embriyolar kas sebebiyet verecek hemisegment başına 30 kasları sahip larva. Beceriksiz kimlik geninin yakınında keşfedilen bir düzenleyici bölge kullanarak, 30 çoklu çekirdekli kasların: 6 hedeflenir. Bu deneyde, ribozomlar için uzama kullanılarak mRNA üzerinde immobilize edilirsikloheksimid inhibitörü. Sitosolik ekstraktlar daha sonra GFP antikor kaplı manyetik boncuklar ile afinite temizliği için kullanılır. Saflaştınldı RNA kalitesi Bioanalyzer kullanılarak doğrulandı. Kantitatif PCR, ters transkripsiyon (RT-qPCR) özgüllüğü ve mRNA izole duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir ve optimum protokolü çok etkili olduğu gösterilmiştir.

Protocol

1. Fly Hattı Üretimi İki farklı yapıları oluşturmak. İlk yapıda, RpL10A cDNA'sı (ribozomal protein alt-birim L10a) pUASP-PL-GFP-nter plazmidi içine GFP alt klonlanır (32'den versiyonu değiştirilmiş). Bir germ promoterinin kullanılması transgenik hattı daha polivalan tüketimine olanak sağlar. Not: pPTGAL4 plasmidi kullanılarak GAL4 (TF) yukarı sarkma geninin doku spesifik ifade sürüş düzenleyici sekansı klonlanmasıyla ikinci yapı elde edilir. 1118 sinekler w içine ayrı ayrı plazmidler enjekte edilir ve 33 (standart prosedüre göre) P-eleman yerleştirilmesi ile sinek genomuna yapıları yerleştirin. Sırayla seçin transformants iki farklı kromozomlar üzerinde yapılarla sinek hatlarını kurtarmak için. Nihai TRAP satır bir çift transgenik istikrarlı bir çizgi elde etmek için bu iki satır (genetik haçlar) birleştirilerek oluşturulur. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6BX w; cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Devasa bu çizgiyi yükseltmek ve istenen aşamalı embriyolar toplamak. 2. Embriyo Koleksiyon Kafes başına genç sineklerin yaklaşık 40 gr içeren 8 büyük silindirik nüfus kafesleri hazırlayın (180,000 sinekler / kafes civarında). Sinekler onların yumurta kanalına gelişmekte embriyolar temizlemek için izin sözde öncesi duracak şekilde devam edin. Bunun için, katılaşmış agar ve üzüm suyu bir karışımını içeren iki 11 cm-çapında petri çanakları üzerine, 1 saat boyunca sinekler koymak ve taze yapılmış maya hamurlu yüzeyinin ⅓ kapsamaktadır. Üzüm 3 borsalarında sonra suyu plakalar benzer taze yapılmış plakalar üzerinde gerçek embriyolar toplamak. NOT: İnkübasyon süresi çalışılan gelişimsel zaman pencereye göre değişecektir. Kafeslerden plakaları çıkarın ve addit (ör: Yumurtlama 3 saat + 10 saat, doğru gelişim aşamasını elde etmek için gerekli süre aynı sıcaklıkta onları terkional inkübasyon 10-13 saat yumurtlama (AEL)) sonra sahneye gelen embriyolar verir. Bir fırça kullanarak 50 ml su ile plaka içeriği (embriyolar, maya salçası, ölü sinekler) süspanse edin. Ölü sinek embriyolar ve kalan vücut parçaları ayırmak ve daha küçük çaplı elek üzerinde kalan embriyolar toplamak, daha sonra deiyonize su kısaca yıkamak için elekler (700 mikron, 355 mikron, 112 um) bir dizi üzerinden gidin. Bu elekler yapışmasına neden olabilir olarak koleksiyon başına en fazla 18 plakları kullanmayın. Deiyonize su içinde% 4.5 çamaşır suyu Dechorionate embriyolar, 2 dakika ve 30-60 saniye boyunca iyonu giderilmiş su ile iyice yıkayın. Çalkalama altında oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca PBS% 0.01 Tween 20, 100 ug / ml sikloheksimid embriyolar inkübe edin. Selüloz emici yaprak Kuru embriyolar ve mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz. Tüpleri tartılır ve sıvı azot içine daldırma ile embriyolar flaş dondurma. Bu aşamada, kurutuldu, embriyolar, -80 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir. <pclass = "jove_title"> 3. GFP Antikor için Coupled Manyetik Boncuk hazırlanması İyice hafif çalkalama orijinal şişesinde protein G manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. Transferi 90 bir RNaz ücretsiz tüp boncuk ul ve bir mıknatıs (30-60 saniye) onları toplamak. Boncukların 90 ul 60-80 mg / ml proteinlerini içeren lizat 1 ml immünopresipitasyon (İP) gerçekleştirmek için gereklidir. Boncuk doygunluğu önlemek için oranları uyun. Protein miktarına göre birkaç tüpleri kullanın. Mıknatıs üzerinde Wash 1 × PBS% 0.01 Tween 20 (500 ul) ile boncuk ve boncuk toplamak süpernatant atmak için. Tanelere PBS% 0.01 Tween 20 350 ul GFP antikorun 30 ug ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırma sonunda boyunca yavaş ucu ile inkübe edin. Mıknatısın (30-60 saniye) ile ilgili boncuk toplayın süpernatan atılır ve polisom ekstraksiyon tampon 500 ul yıkayın (Hepes, 10 mM, KCI, 150 mM, MgCI2, 5 mM DTT, 0.5 mM, Triton% 1, Sikloheksimit 100 ug / ml , Protease 1 x inhibitörü, RNaz inhibitör 100 U). Mıknatıs üzerine boncuk toplayın ve engelleme tampon 500 ul ekleyin (BSA 0.1 ug / ul, maya tRNA 0.1 ug / ul, Polizom ekstraksiyon tamponu içinde 0.1 ug / ul glikojen). Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe ve taze bloke edici tampon ile bir kez bu adımı tekrarlanır. Daha sonra boncuk hatırlamak ve immünolojik saflaştırma adım (bölüm 6) hemen geçin, mıknatıs üzerinde boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu 500 ul durulayın. 4. Lizat Hazırlama Başlamadan önce, çok yönlü hızlı hızlı boncuk değirmeni programı kurmak: 2 × 10 sn rpm 5.000, 15 saniye duraklama. 15 ml tüpler transfer kurutuldu embriyolar (1.5 g) polisom ekstraksiyon tamponu ihtiva eden buzda önceden soğutulmuş ve hemen homojen hale getirilir. Polizom ekstraksiyon tamponu 4 ml embriyoların 1,5 g örnek. Iki Yayılması homojenize embriyolar 2 ml tüpler önceden soğutulmuş ve Embry öğütmekhomojenleştirici programını çalıştırarak os. Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpleri içine lizat aktarın ve 2000 g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile Postnükleer süpernatant hazırlar. Buz üzerinde taze önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın süpernatant (son konsantrasyon =% 0.1)% 10 Nonidet P-40 1/100 numune hacmi ekleyin ve tüp tersini hafifçe karıştırın. Darbe santrifüj minifuge örnek tüpün altındaki sıvıyı toplamak 300 mM 1,2-Diheptanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DHPC) (nihai konsantrasyon 1/9 numune hacmi = 30 mM eklemek )), tüp tersini hafifçe karıştırın ve inkübasyon sırasında birkaç kez tersini (5 dakika karışımı buz karışımı kuluçkaya yatmaktadır. 20.000 g'de 10 dakika süre ile 4 ° C'de santrifüj ile sonrası mitokondriyal süpernatant hazırlayın. Bradford metodu ile protein konsantrasyonu ölçülür: lizat konsantrasyonu 60-80 mg / ml arasında olması gerekir. Tyepyeni bir önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatantı ake ve ön emilim aşamasında (bölüm 5) hemen geçin. 5. Ön emilim İyice hafif çalkalama ile manyetik boncuklar tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj tüpüne (boncuk / 1 mi, embriyonik lizat 30 ul) boncuk 30 ul transfer. Süpernatant kapalı, mıknatıs üzerinde pipet boncuk toplayın ve Polizom ekstraksiyon tamponu (500 ul) boncuklar tekrar süspansiyon. Mıknatısa boncuk toplayın embriyonik lizat ekleyin ve bir döndürücüde 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. Boncuk çıkarın ve immünolojik saflaştırma adımı için buz üzerinde supernatant tutun. Immün-önce, örneğin, RT-qPCR immün-sonra toplanan RNA numunesinin, küresel RNA örneği karşılaştırma süpernatan 100 ul (giriş) tutun. 6. immün- Ve (60-80 mg / ml protein tekabül eder) 1 mi eklemeGFP antikora bağlanmış bloke boncukların 90 ul ihtiva eden bir RNaz içermeyen tüpe lizat önceden absorbe edildi. Tüp rotator nazik ucu-üzerinde uç karıştırma ile 2 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edin. Alternatif olarak, 4 ° C 'de inkübasyon O / N gerçekleştirin. Kuluçkadan sonra, mıknatıs üzerinde boncuk toplamak. Daha sonra 0.5 mM, sikloheksimid 100 ug / ml, RNaz inhibitör 100 U yıkama tamponu 500 ul (Hepes, 10 mM, KCl 350 mm, MgCI2, 5 mM, Nonidet P-40,% 1 DTT bunları tekrar süspansiyon boncuk aşağı döndürmek için bir minifuge kullanın ) ve mıknatıs bunları toplamak. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Yeni önceden soğutulmuş RNaz ücretsiz tüp boncuk değiştirin ve iki kez yıkayın. Boncukların bir mıknatıs üzerinde toplayın ve boncuk TRIZOL doğrudan 1 ml ekleyerek RNA ekstraksiyon geçin ve üreticinin talimatlarına uyun. 7. RNA Temizlik-up ve Kalite Değerlendirmesi Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Micro Kiti kullanın. Tamamlandığında, elut(x) ul RNaz içermeyen su ile e RNA. 2 60 ° C'de dakikada, ve mağaza sıcak hızlı bir şekilde dondurulup örnekleri -80 ° C'de. Bioanalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin (üreticinin talimatlarına uyun). Traped RNA özgüllüğünü test etmek için, üreticinin talimatlarına (üstsimge III) 'e göre, saflaştırılmış RNA (giriş ve IP) 3 ng ters transkripsiyon gerçekleştirmek. Gene-özgü primer setleri kullanılarak qPCR cDNA kullanın.

Representative Results

Drosophila Embriyonik somatik kas sistemi hemisegment başına 30 kas oluşmaktadır ve her kas özellikleri belirli bir kümesi vardır: kimlik genleri pozisyon, füzyon olayları, bağlanma siteleri ve innervasyonunu sayısının kodu. Belirli bir kas alt kümesi tercüme mRNA belirlenmesi, bu özel kas özelliklerini oluşturmak için gerekli proteinler hakkında bilgi verecektir. Kimlik geni eksprese eden bir sarkma kaslarının alt-popülasyonundan TRAP göre bir yöntem, RNA kullanılarak (Şekil 1A-B) ile saflaştırılmıştır. Bu yaklaşımın önemli bir endişe izole RNA kalitesi ve özgünlüğü olduğunu. Burada bildirilen optimize protokol Bioanalyzer analizi ile değerlendirildi yüksek kaliteli RNA sistematik iyileşme sağladı. Profil elde gösterileri RNA hiçbir bozulma (Şekil 1C). TRAP yönteminin etrafında geliştirilen diğer çalışmalarda, sorular verilerin özgüllüğü üzerine yetiştirildik. Burada bentanecikler veya tüpler RNA bağlama spesifik olmayan ve yıkama tamponu optimizasyonu ile bağlantılı arka bastırmak için bir yöntem mprove. Arka plan düzeyi ve sarkma-ifade eden hücreleri izole edilmesi etkinliğini değerlendirmek amacıyla, aynı embriyon aşaması 3 kez tekrarlanmış RT-qPCR denemeler olmuştur. 4 farklı genlerin-zenginleşme katlayın (MEF2, sarkıtmak, Prospero'ya soxNeuro) RpL32 geninin (Şekil 1D) karşı giriş ve normalize göre hesaplanmıştır. Bu sonuçlar pan-kas gen MEF2 ve beceriksiz geninin 5.6 kat zenginleşme 2.3 kat zenginleştirme gösterdi. Bunun aksine, sinir sisteminde ifade iki gen tükenmiş girişine karşılaştırıldı. Çok benzer kıvrım değişim değerleri protokol sağlam olduğunu gösteren, 3 biyolojik çoğaltır gözlendi. 150 × 10 ^ 6 pozitif (toplam 100 GFP hücre / embriyoyu ihtiva elde edilmiştir 1.5×10 ^ 6 embriyoların yaklaşık 1.5 g ile başlayan Fötr-Gal4 sürücüsü ile vehücreleri) içerir. TRAP deneyi çalıştırdıktan sonra, verim aşamasında-faiz bağlı belirli RNA civarında 25-45 ng olduğunu. Bu malzeme mikroarray analizi veya bir RNA-seq kitaplığı oluşturmak için bir yükseltme protokolü kullanılarak RNA seq çalıştırmak için yeterlidir. Verimlilik RpL10A-EGFP ifade etmek için kullanılan sürücünün gücüne kuvvetle bağlı olacaktır. Şekil 1. Kalite ve Fötr-GAL4> UASRpL10A EGFP embriyolar TUZAK izole RNA özgünlüğü değerlendirilmesi. (AB) hemisegment (A) başına altı Fötr kas hücrelerinde, özellikle RpL10A EGFP ifadesini gösteren bir sahne 16 embriyo Konfokal görüntüler. Genel kas işaretleyici Beta3tubulin ile RpL10A-EGFP Co-lokalizasyon birleştirme resim (B) görülmektedir. (C) traped RNA ra kalite kontrolün Bioanalyzer üzerinde rRNA 18S ve 28S mükemmel bütünlüğünü gösteren. (D) RT-qPCR analizi aşaması-16 embriyoların 3 biyolojik çoğaltır üzerinde TUZAK izole mRNA deneylerinin yüksek spesifite gösteren. Fold değişim girişi ve RpL32 genine karşı normalize göre hesaplanır. Tüm kas soy mevcut MEF2 transkript daha kısıtlı sarkma transkript 5.6 kat zenginleştirilmiş iken girişine oranla 2.3 kat zenginleştirilmiş bulunmaktadır. Nöral Prospero ifade hücreleri ve soxN genleri 2.2 kat ve sırasıyla 5.5 kat tükenmiş. Hata çubukları standart sapmayı temsil etmektedir (n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu yazıda Drosophila embriyolar nadir hücre popülasyonlarının araştırmaya adanmış bir modifiye Tercüme Ribozom Affinity Arıtma protokolü (dublaj 'TRAP-rc') da açıklamaktadır. Bilgi mikrodizi ya da RNA seq analizi, embriyo lizizi ve polisom çıkarılması için, yani, 1) gerekli olan biyolojik maddenin miktarı ve optimize edilmiş prosedür için uygun olan bir verim ile spesifik RNA izolasyonu için başarılı bir şekilde önemli adımlar sağlanır; 2) Taneler, / antikor-to-lisat uygun immüno-çökeltilmesi oranları; Yüksek özgüllük ve duyarlılık ile TUZAK-rc deneyler çalıştırmak üzere 3) yıkama tamponu kompozisyonu da dahil olmak üzere arka azaltılması izin yineleyin.

Bu protokol, hali hazırda herhangi bir başka hücre türlerine de uygulanabilir hale tekrarlanabilir verileri elde edilir. Bu teknik, aktif-çeviri mRNA düzeyinde farklı gen ekspresyonunu analiz etmek ve böylece spec protein ifadesini anlamak için yolunu açmak için mümkün kılar Belirli bir zaman penceresinde IFIC hücre tipi. Protein bolluk çeviri ve bozunma süreçlerinin hızına bağlıdır olacağı unutulmamalıdır. TRAP yöntemin önemli bir sınırlama, doğru bir kantitatif olarak protein içeriğini ölçmek ya da çeviri sonrası bir modifikasyonu algılamak için yetersizliğidir. Bir hücre tipi özel bir şekilde, bu sayede, mRNA gövdesi boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesiyle miktarının iyileştirilmesi ve ribozom çok güçlü bir araçtır içi izi ile birlikte TRAP yapabilir. Yeni bir kağıt 34, bu kombine, insan embriyonik böbrek 293 hücreleri içinde yapıldı. Yazarlar, streptavidin boncuk kullanılarak RpL10A bir uyarılabilir biyotinilat edilmiş form biçiminde afinite saflaştırma ile nükleaz ayak izi bitti. Bu sınırlama amaç için gerekli biyolojik malzeme miktarı olan belirli bir hücre tipi hedefleme yaparken bütün organizmanın ribozom footprinting gerçekleştirmek mümkün olduğu ilkesine bir kanıtıdır.

"> Küresel transkriptomik analizler paralel TUZAK deneyler yapılması mümkün yeni transkripsiyonu ve RNA tercüme de aktif. Bu özel gelişimsel bağlamlarda veya belirli hücre popülasyonlarının yer alan potansiyel transkripsiyon sonrası mekanizmalar derinden bilgilendirici olacak arasındaki oranlar izlemek yapacak Örneğin tarafından- mikroRNAlar.

Sonuç olarak, TRAP hücreye özel bir şekilde aktif-çeviri ribozom bağlı RNA belirlenmesi için yüksek verimli, spesifik ve hassas bir yöntem olup. Bu yöntem, organizmalar ve doku tiplerinin geniş bir yelpazede kullanılabilir. Burada tarif edilen yeni TRAP-rc protokolü nadir bir hücre popülasyonlarının (toplam hücre sayısının% 1'den daha az) ve tam genom düzeyinde daha sonraki analizler için yeterli bir son malzemenin miktarı için optimize edilmiştir.

Bu yöntemin olası bir sınırlama kompozisyonu için yeterli miktarda isim levhası ribozomları üretilmesi için güçlü bir sürücünün bir gerekliliktirHedeflenen hücre tipinde endojen etiketsiz olanlar ile ete. Yeni bir çalışmada 25, yazarlar% 10-30 kadar etiketsiz ribozom karşı etiketlenmiş oranını tahmin.

Ölçüde bu dengeyi geliştirmek gerekir UAS-RpL10A EGFP kopya sayısını artırarak bu sorunu aşmak için. Seçenek olarak ise, anlatılan genetik arka plan bir UAS GAL4 transgeni eklenmesi GAL4 proteininin üretimini yükseltmek ve dolaylı RpL10A-EGFP ifadesini arttırır. Bu mRNA üzerinde etiketli ribozomların daha iyi bir doluluk lehine olmalıdır.

Bu zaten verimli bir yaklaşım daha güçlü, daha nicel yönünü getirmek veya keşfetmek ve gen ifadesi kontrolü için gerekli olan moleküler mekanizmaları çözülmeye tamamlayıcı yöntemler adapte yapılabilir unutmayın.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

Materials

HEPES Sigma  H4034-1006
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850306P
Glycogen thermo scientific  R0561
Purified BSA 100X  Biolabs B9001
Yeast tRNA  Sigma R5636
Super RNase In  Ambion AM2694
Antibody GFP clone N86/38 UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated 75-132 
Nonidet P40  Roche 11754595001
Precellys 24 Lysis homogenisation  Bertin Technology
Nuclease free water  Nalgene
Dynabeads ProteinG Invitrogen 10004D
Potassium chloride (KCl) Applied Biosystem  AM96406
Magnesium Chloride (MgCl2)  Applied Biosystem  AM95306
Cellulose waddin unbleached  VWR 115-2597 
Sieves 112, 355, 710 um  Retsch
TRiZol  Invitrogen 15596-018
MagRack 6 GE HealthCare  28948964
Low binding filter tips  ClearLine
Rnase free tube 1,5 mL  ClearLine 390689DD
Tween 20  Fischer Bioreagent  BP337-500
Cycloheximide  Sigma  C1985
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free  Roche 11836170001
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
  2. Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
  3. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
  4. Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
  5. Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
  6. Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
  7. Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
  9. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
  10. Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
  11. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  12. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
  13. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  14. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
  15. Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
  16. Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
  17. Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
  18. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  19. Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
  20. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  21. Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
  22. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
  23. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
  24. Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
  25. Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
  26. Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
  27. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
  28. Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
  29. Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
  30. Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
  31. Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
  32. Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
  33. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
  34. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).

Tags

TRAPTranslating Ribosome Affinity PurificationRare Cell PopulationsDrosophila EmbryosMRNA TranslationCell-type-specificTranslatome AnalysisPolysomesTagged Ribosomal SubunitDevelopmental ProcessesDisease ProgressionCell-specific Gene ExpressionMicroarrayRNA-seqGal4/UAS SystemMuscle Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (103), e52985, doi:10.3791/52985 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image