Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Resistencia Myxovirus (Mx) las proteínas son una parte importante de la defensa inmune innata contra los patógenos virales. Estas proteínas son grandes GTPasas-dynamin como que son inducidos por el tipo I y tipo III interferones. Los genes MX correspondientes están presentes en casi todos los vertebrados en una o varias copias y sus productos génicos inhiben una amplia gama de virus, incluyendo Orthomyxoviridae (por ejemplo., Virus de la gripe), Rhabdoviridae (por ejemplo., Virus de la estomatitis vesicular), Bunyaviridae (por ejemplo. , el virus de la crosse) y Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana-1) ^1-4. No está claro cómo estas proteínas reconocen una amplia gama de virus tales, sin ninguna secuencia primaria compartida aparente motivos en estos virus. El análisis de la interacción de proteínas Mx con sus objetivos virales, potencialmente involucra complejos de orden superior con otros factores de la célula huésped, le ayudará a comprender los mecanismos moleculares tsombrero de haber evolucionado en la carrera armamentista entre los virus y sus anfitriones.

La interacción entre las proteínas de mamíferos Mx y objetivos virales se ha estudiado más ampliamente para MxA humano. MxA humano puede inhibir la replicación de muchos virus, incluyendo el ortomixovirus influenza A y virus Thogoto. MxA une los complejos de ribonucleoproteína virus Thogoto (vRNPs), impidiendo de este modo su entrada nuclear, lo que resulta en el bloque ⁵ de la infección. Esta interacción entre MXa y Thogoto vRNPs virus se ha demostrado con co-sedimentación y co-inmunoprecipitación experimentos ^6-9. Cómo proteínas Mx obstaculizan virus de influenza A que está menos claro. Un problema importante es que no es fácil de demostrar una interacción entre una proteína Mx y un producto génico influenza. Un informe mostró una interacción entre MxA humana y la proteína NP de la gripe A células infectadas por virus ^10. Esta interacción sólo se pudo demostrar por co-immunoprecipitation si las células habían sido tratados con los ditiobis reactivo de reticulación (propionato de succinimidilo) antes de la lisis, lo que sugiere que la interacción es transitorio y / o débil. Estudios más recientes han demostrado que el diferencial Mx sensibilidad de las distintas cepas de la gripe A se determina por el origen de la proteína NP ^11,12. En línea con esto, los virus de la influenza A pueden escapar parte del control Mx mutando residuos específicos en la proteína NP ^13. Esto sugiere que el principal objetivo de los virus de la gripe A para el host Mx es la proteína NP, probablemente NP montado en complejos vRNP. Sin embargo, ninguno de estos estudios más recientes demostraron una interacción entre la gripe NP o vRNPs y, o bien MxA humano o de ratón Mx1.

Recientemente hemos demostrado, por primera vez, una interacción entre la influenza NP y la proteína Mx1 de ratón con un protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado ^14, que se describe aquí en detalle. En general, co-immunoprecipitation es uno de los enfoques bioquímicos utilizados más frecuentemente para investigar las interacciones proteína-proteína. Esta técnica se prefiere a menudo sobre las técnicas alternativas, por ejemplo, dos híbridos de levadura, ya que permite investigar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural. Co-inmunoprecipitación se puede llevar a cabo en las proteínas expresadas endógenamente si los anticuerpos contra las proteínas de interés están disponibles. Alternativamente, las proteínas de interés se pueden expresar en la célula a través de la transfección o infección y una etiqueta de afinidad pueden ser utilizados. Además de las ventajas mencionadas anteriormente, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite la detección de interacciones débiles y / o transitorios de proteínas. El componente principal de este protocolo optimizado es la adición de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de lisis celular. NEM es un reactivo de alquilación que reacciona con los grupos tiol libres tales como presente en cisteínas, a un pH de 6.5 a 7.5, para formar un éster tio-estable(Figura 1). A mayor pH, NEM también puede reaccionar con grupos amino o someterse a hidrólisis ^15. NEM se utiliza típicamente para bloquear los grupos tiol libres, con el fin de prevenir la formación de enlaces disulfuro o inhibir la actividad enzimática. Por ejemplo, NEM se utiliza a menudo para bloquear enzimas desumoylating, que son proteasas de cisteína. En el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita, NEM se incluyó en el tampón de lisis porque había sido informado de que la sumoilación de las proteínas de la gripe puede influir en la interacción entre las proteínas virales ^16. Inesperadamente, la adición de NEM resultó ser clave para documentar la interacción entre la gripe NP y el ratón Mx1 por co-inmunoprecipitación. No está claro por qué la adición de NEM es crucial para detectar la interacción NP-Mx1. Posiblemente la interacción es demasiado transitoria y / o débil. NEM podría estabilizar la interacción, por ejemplo, mediante la preservación de una conformación específica de Mx1, una proteína viral o incluso un tercero desconocido componente. Tal efecto estabilizador de NEM se ha observado antes, por ejemplo, para la interacción entre la ribonucleótido reductasa M1 y su gemcitabina inhibidor (F2dC) ^17. Mx1 y NP ambos contienen múltiples residuos de cisteína que podrían ser modificados por NEM. Por ejemplo, un estudio reciente de Rennie et al. Demostró que una variante sin pecíolo MxA contiene tres residuos de cisteína expuestos de disolventes que pueden ser modificados por yodoacetamida. La mutación de estos residuos de serinas no influyó en la actividad enzimática de MxA, pero impide la agregación mediada por disulfuro de ^18. Como estas cisteínas se conservan en Mx1, esto sugiere que las cisteínas análogos en Mx1 pueden ser modificados por NEM y como tal influencia su conformación o solubilidad. Además, NEM también podría afectar a la actividad GTPasa de Mx1, que es esencial para la actividad anti-influenza de Mx1, y con ello estabilizar la interacción entre Mx1 y NP. Sin embargo, un efecto directo de NEM en la GTPasa actividad de Mx1 es improbable, ya que también se requiere NEM para detectar la interacción entre la gripe NP y GTPasa mutantes inactivas de la proteína Mx1 ^14. Claramente, se necesita más investigación para desentrañar el efecto de NEM en la interacción NP-Mx1.

En resumen, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite estudiar la interacción entre la proteína antiviral Mx1 y su diana viral, la proteína NP de la gripe. Este protocolo también podría ser utilizado para estudiar otras interacciones débiles o transitorios que dependen de la estabilización de las conformaciones de proteínas específicas. Interacción proteína-proteína que dependen de conformaciones específicas se han descrito antes, por ejemplo, para las proteínas de unión a calcio tales como calmodulina ^19. Por último, el papel beneficioso de NEM también podría ser utilizado en otros métodos que detectan interacciones proteína-proteína, tales como ensayos de co-sedimentación.