Новое применение электрического проникновение график (EPG) на приобретение и измерения электрических сигналов в флоэмы сито элементов

Способность продуцировать междугородные электрические сигналы является выгодным черта многоклеточных организмов, что позволяет эффективно в ответ на внешние раздражители. Эта черта развилась независимо в растениях и животных, и, таким образом, представляет собой случай конвергентной эволюции. Учитывая, что электрические сигналы в сочетании с важных функций в организме животных, таких как нейронные передачи и сокращение мышц, молекулярной основы, механизма передачи, и функции стимул-индуцированной электрических сигналов у животных являются объектами интенсивных исследований. В отличие от этого, стимул-индуцированной электрической сигнализации в растениях получил небольшое исследование внимания. Хотя растения не имеют нервы или мышцы, там, кажется, достаточно доказательств, чтобы предположить, что стимул-индуцированной электрические сигналы в растения играют ключевую роль в их ответах на факторы окружающей среды.

Флоэмы, живой компонент растительного сосудистой, было постулировано в качестве основного субзали для передачи стимула-индуцированной электрических сигналов, из стимулированных / повреждены в нестимулированных / неповрежденные участки ^2. Основные клетки в флоэмы являются сито элементы (СЭС), относительно простые, удлиненные клетки. Концы Сес подключены к другой МП, образуя непрерывный, низким сопротивлением, системы сито трубка, которая распространилась по всему растению. Есть, однако, очень мало исследований на электрических свойствах этих узкоспециализированных клеток. В этих предыдущих исследованиях, ученые обращались МП либо с стеклянные микро-электродов ³ или стеклянными электродами, которые были соединены, чтобы привить-вставленные стилеты тлей, после stylectomy (резка) ^4. Стеклянные микроэлектродов изготовлены из стеклянных капилляров, что тянутся на одном конце с тепла в тонкий кончик менее 1 мкм в диаметре, а затем заполняют раствором KCl. Ag / AgCl или платиновой проволоки, вставляются в KCl-заполненной стеклянного электрода затем подключен к входу усилителя, а референтомЭлектрод вставляется в ванну окружающей клетку интерес, замыкая цепь. Эта установка записывает разность потенциалов между внеклеточной референтного электрода и внутриклеточной измерительного электрода, т.е. мембранного потенциала клетки ^5. С помощью этого метода, Umrath сделал первый внутриклеточный запись из растительной клетке, с использованием водорослей Nitella ^6,7. Nitella является относительно простой организм, крупных клеток, и, следовательно, поддаются внутриклеточных электрофизиологических экспериментов. В отличие от этого, введение внутриклеточных стеклянных электродов в небольших клетках многоклеточных, трехмерных наземных растений технически сложных, требует высокой квалификации исследователя, а также сложную визуализацию, микроманипуляции, и анти-вибрации оборудования. Хотя стеклянные электроды пригодны для записи из поверхностных клеток в растениях, таких как корень клеток эпидермиса ^8, внутриклеточный recordinGS из клеток глубоко укоренились в ткани растения, такие как МП, повреждение индуцированных ответов очень вероятная причина, путая результаты. В 1989 году Фромм и Eschrich сообщили об использовании альтернативного метода, который называется «метод тли ', в котором стеклянные электроды, соединенный с тлей стилетами после stylectomy ^4. Метод тля является минимально инвазивной, потому что гибкие стилеты не вызывают тканей или клеток повреждения также, как стеклянные электроды. Тли стилеты являются великое изобретение природы для проникновения растений и тлей значительно более опытный, чем люди в поиске МП. К сожалению, этот метод тля также весьма требовательны в плане технической экспертизы и оборудования. Кроме того, успех каждого эксперимента, который реализует этот метод полностью зависит от тли, находящегося в режиме подачи – с стилета стабильно, вставленной в SE, во время stylectomy. Думая в ретроспективе, можно увидеть, что шансы на успех этого метода можно было бы Improved путем добавления к экспериментальной установки инструмент, который позволяет идентифицировать или не тля стилет в SE при применении stylectomy.

В 1964 году, Маклин и Кинси описал "электронную систему контроля" для изучения пищевого поведения тлей в режиме реального времени ^9,10. В этой системе, тля и стилет-проник растений были интегрированы в электрической цепи. Позже, в 1978 году, Tjallingii разработали модифицированную версию системы, называется "Электрические Проникновение График" (EPG) системы ^11,12. В то время как оригинальный электронная система контроля был чувствителен к сопротивлению, исходящих потенциалов только с системой EPG, электродвижущая сила (ЭДС) возникла потенциалы, т.е. генерироваться на заводе или в насекомого, может быть записан в дополнение к потенциалам, вытекающих из сопротивление (R) в насекомого. Это представляет собой значительное улучшение, потому что как компоненты сигнала, ЭДС и R,обеспечить биологическую соответствующую информацию о событиях во время проникновения растений тлей. Что делает EPG предварительного усилителя чувствительны к R-компонентов является его относительно низкая входное сопротивление 1 ГОм, что близко к среднему значению сопротивления растений / тли. Небольшое напряжение смещения (Рисунок 1, V) приблизительно +100 мВ подается на заводе, который затем разделяется по растений и насекомых, с одной стороны, и входным сопротивлением, с другой стороны. Напряжения и их изменения измеряются в точке (рис 1а, б) между насекомым и входного резистора. Таким образом, R-компоненты представляют растительные тли сопротивления модуляции напряжения смещения, в то время как ЭДС-компоненты некоторая доля растений потенциалов на кончике стилета и потенциалов, вызванных в насекомое. Растительные потенциалы – наиболее значимые здесь – в основном мембранные потенциалы клеток растений проколоты тли стилетами. Насекомое потенциалы появляются, в основном,Потоковое потенциалы, вызванные движениями жидкости в течение двух стилета каналов, то есть, еда и слюнные каналы; никаких внутренних нервных или мышечных потенциалов не отражаются в EPG. На практике стилет наконечник функционирует как кончиком электрода. Все растительные клетки отрицательно заряженные внутри по отношению к положительному вне клетки. Электрический ток (т.е. движение ионов в водном растворе), вытекающих из внутренней во внешнюю и наоборот очень ограничено из-за высокой стойкости к клеточной мембране. Обычно потенциал покоя поддерживается постоянным. Однако, когда отрицательные ионы выйти или положительные ионы перемещаются через клеточную мембрану, мембранный потенциал уменьшается, т.е., это деполяризует '. Деполяризация происходит в случае возбуждения клеток. Ионы затем перейти в систему или, когда конкретные ионные каналы в мембране открываются или когда мембрана повреждена и ионы течь в и. Все клетки имеют ионные каналы и насосы в тон плазматической мембраны, которые приносят мембранный потенциал к уровню покоя, восстанавливая исходную концентрацию различных ионов внутри клетки. Потенциал покоя его изменения ЭДС компоненты, и, следовательно, метод EPG подходит для измерения их.

Рисунок 1. EPG-электроды. EPG-электрод является живым тли интегрированы в электрическую Проникновение График (EPG) цепи, чьи стилет вставлен в сито элемента (СЭ) в стабильном режиме подачи. Если стилет-пронзил SE находится в состоянии покоя (панель А), напряжения в цепи, записанного EPG, является стабильным и в покоящейся потенциального уровня (Панель C, отдых). Если SE возбуждается, его мембрана деполяризует (панель B), который визуализируется в EPG, как постепенное увеличение напряжения (панель C, деполяризации). Как ионного баланса в SE возвращает отдохнуть, то есть, это repolarзует, напряжение регистрируется EPG постепенно уменьшается до отдыха потенциального уровня (Панель C, реполяризации). В панели С, "А" и "Б" относятся к сценариям, представленным на панелях А и В, соответственно. V = Регулируемый источник напряжения смещения. Ri = вход резистор. Параллельно с внешним резистором 1 ГОм, усилитель имеет внутренний (в ОУ) высокая 1.5 ТОм резистор (панели А и В, в серый). По дистанционного управления выключателем EPG предварительного усилителя может быть изменена от нормальной до ЭДС-режим, который позволяет получить очень точные значения напряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В следующем разделе мы предоставляем читателю базового протокола проведения экспериментов EPG, которая действует для обоих насекомых и растений сосредоточена ориентированных исследований.