L'isolement et la transplantation de différents âgées murins thymiques greffes.
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Les mécanismes qui régulent l'efficacité de la sélection thymique restent mal définis. La méthode présentée ici permet dans les analyses in vivo du développement et de la sélection des cellules T spécifiques de soi et des antigènes étrangers. L'approche implique l'implantation de greffes de thymus provenant de souris âgées dans divers destinataires SCID immunodéficientes. Au cours d'une période relativement courte de temps les destinataires sont entièrement reconstituées avec des cellules T dérivées du thymus greffon implanté. Ensemencement Seulement thymocytes le thymus au moment de la sélection et de l'isolement subissent développer en cellules T matures. En tant que tel, les changements dans la nature et la spécificité des cellules T greffées en fonction de l'âge thymiques événements dépendants peuvent être évaluées. Bien que l'expertise technique est nécessaire pour la transplantation thymique succès, cette méthode fournit une stratégie unique d'étudier in vivo un large éventail de pathologies qui sont dues à un ou résultat de la fonction et / ou homeostas thymique aberranteest.
Introduction
Le thymus est un organe dans lequel les événements critiques dans le développement des cellules T se produisent 1. Thymocytes résidents, sur réarrangement du récepteur des cellules T (TCR) α et β gènes, sont soumis à une série d'interactions avec des cellules de lymphostromal et présentant l'antigène (APC) dans les régions corticales et médullaires du thymus 2. Sélection positive thymique est médiée par les cellules épithéliales thymiques corticales (TEC) pour produire thymocytes qui reconnaissent des peptides antigéniques dans le contexte de l'hôte du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et II molécules 2-3. Après sélection négative thymique implique purge des thymocytes autoréactifs, entraînée par une interaction avec TEC médullaire ou des cellules dendritiques (DC) que les peptides présents dérivés de protéines du soi liés par le CMH de classe I et II 3 molécules. Le résultat de ces processus final est la création d'un pool de cellules matures CD4 + et CD8 + T en mesure de répondre à un large éventaildes antigènes étrangers tout en présentant une réactivité minimale de quatre protéines du soi.
L'efficacité des événements de sélection thymiques est influencée par une multitude de facteurs, y compris la maturation thymique, la fréquence des médullaire et corticale TEC, la composition de sous-ensemble de thymique DC, et la source des précurseurs thymiques 3. Notamment, la sélection thymique aberrante peut entraîner des auto-immunes 5 ou immunodéficientes pathologies, qui découlent de la sélection négative ou positive avec facultés affaiblies, respectivement. Les événements moléculaires régulant la sélection thymique, cependant, sont mal comprises. Approches in vitro tels que des cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) 6, se sont avérées utiles pour l'analyse des événements de base associés à la sélection thymique, mais ne parviennent pas à récapituler pleinement la dynamique des cours dans les événements vivo. En conséquence, cette approche basée sur la transplantation-thymique a été créé afin de mieux les événements de sélection des thymocytes d'étude in vivo 7 </sjusqu'à>.
Ce protocole décrit la transplantation thymus de souris donneuses nouveau-nés et les adultes dans des souris immunodéficientes SCID bénéficiaires. Cette technique permet l'étude des mécanismes qui régissent la sélection thymique positive et négative, ainsi que la sortie du thymus de différents sous-ensembles de cellules T au cours de l'ontogenèse. Plus récemment, cette approche a été utilisée pour démontrer que l'efficacité de la sélection thymique est limitée tôt après la naissance chez la souris conduit à un développement accru de lymphocytes T auto-réactifs, et un répertoire des cellules T réduite spécifiques pour des antigènes étrangers 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
References
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