التحول Biolistic هو طريقة تستخدم لتوليد التكامل مستقر من الحمض النووي في الجينوم من الانتهازية الأدعومية الممرض المستخفية من خلال إعادة التركيب مثلي. وسوف نظهر التحول biolistic من بناء، والتي لديها خلات كيناز ترميز الجينات تنصهر إلى العلامة فلوري mCherry إلى C. الأدعومية.
وbasidiomycete المستخفية المورمة، وهو ممرض الانتهازية الغازية من الجهاز العصبي المركزي، هي السبب الأكثر شيوعا لالتهاب السحايا الفطرية الناتجة في جميع أنحاء العالم في أكثر من 625،000 حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. وعلى الرغم من وضعت Electroporation للللتحول من البلازميدات في المستخفية، ويوفر تسليم biolistic فقط وسيلة فعالة لتحويل DNA الخطية التي يمكن دمجها في الجينوم عن طريق إعادة التركيب مثلي.
وقد تبين خلات أن يكون المنتج التخمير كبير خلال العدوى بالمستخفيات، ولكن أهمية هذا ومن غير المعروف حتى الان. وهناك مسار البكتيريا تتكون من الانزيمات زايلولوز-5-فوسفات / الفركتوز-6-فوسفات فسفوكيتولاز (XFP) وكيناز خلات (ACK) هو واحد من ثلاثة مسارات محتملة لإنتاج خلات في C. الأدعومية. هنا، علينا أن نظهر التحول biolistic لبناء،الذي الجين ترميز ACK تنصهر إلى العلامة الفلورسنت mCherry، إلى C. الأدعومية. نحن بعد تأكيد تكامل الانصهار ACK -mCherry في موضع ACK.
Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide 1. Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection 2,3,4, and genes encoding enzymes from three putative acetate-producing pathways have been shown to be upregulated during infection 5. This suggests that acetate production and transport may be a necessary and required part of the pathogenic process; however, the significance of this is not yet understood. One possible pathway for acetate production is the xylulose 5-phosphate/fructose 6-phosphate phosphoketolase (Xfp) – acetate kinase (Ack), a pathway previously thought to be present only in bacteria but recently identified in both euascomycete as well as basidiomycete fungi, including C. neoformans 6.
To determine the localization of these enzymes of this pathway in the cell, a construct carrying a neomycin resistance gene downstream of an ACK gene fusion to the fluorescent tag mCherry (ACK:mCherry:Neo) will be introduced into C. neoformans using the well-established method of biolistic transformation 7,8. Although electroporation is an efficient method for transformation of plasmids that will be maintained as episomes into Cryptococcus 9, it is not useful in creating stable homologous transformants 8. Only biolistic delivery using a gene gun provides an effective means to transform linear DNAs that will be integrated into the genome by homologous recombination. For example, Edman et al. showed that of the transformants resulting from electroporation of a plasmid-borne URA5 selectable marker into C. neoformansura5 mutants, just 0.001 to 0.1% of transformants were stable 9. Chang et al. achieved just a 0.25% stable transformation efficiency using electroporation to reconstitute capsule production in an acapsular mutant 10. Unlike electroporation, biolistic transformation has been shown to result in stable transformation efficiency of 2-50% depending on the gene that is being altered 7,8,11.
This visual experiment will provide a step-by-step demonstration of biolistic transformation of the linear ACK:mCherry:Neo DNA construct into C. neoformans, and will describe how to confirm its proper integration via homologous recombination into the ack locus. The protocol demonstrated here is a modification of the method developed in the Perfect laboratory 8.
Utilizing this protocol, biolistic transformation can be accomplished in which linear DNA is integrated into a desired locus in the Cryptococcus neoformans genome by homologous recombination. Certain steps in the protocol can have a dramatic effect on the effectiveness/efficiency of the transformation. For a successful transformation, it is imperative that the DNA utilized in the shoot has a concentration of at least 1 µg. However, the volume of DNA added to the gold beads can be increased in the chance the…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من الجوائز من مؤسسة العلوم الوطنية (جائزة # 0920274) وساوث كارولينا تجربة مشروع محطة SC-1700340. هذه الورقة isTechnical مساهمة رقم 6283 من محطة تجربة جامعة كليمسون. الكتاب أشكر الدكتور لوكاس Kozubowski للحصول على المشورة المفيدة له في تطوير هذا البروتوكول النهائي والدكتور شيريل انجرام سميث، كاتي جلين، وغريس Kisirkoi لقراءة نقدية لها من المخطوطة.
Product | Company | Catalog # | Website |
0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
G418 – Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
Mini Beadbeater – 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |