هنا، نقدم بروتوكول لتوليد نوع ثنائي التكافؤ اتش 5 (Ad5) ناقلات إثبات صحة المبدأ Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس. وقد تجلى هذا متجه لعرض اللياقة البدنية النوعية، والقدرة على الهروب الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر، واستضداد وكذلك المناعية لمستضدات يدمج.
اتش المصلي 5 (Ad5) تم تعديل نطاق واسع مع أساليب التحوير التقليدية لتطوير لقاح. وكفاءات انخفاض هذه النواقل Ad5 تعديل تقليديا في التجارب السريرية يمكن أن تكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 الحصانة موجودة من قبل (PEI) بين الغالبية العظمى من السكان. لتعزيز التنمية قاح تنقلها Ad5 من خلال حل قلق Ad5 PEI، واستخدمت استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. من خلال ميزة هذه الاستراتيجية، Ad5-تنقلها نحن بني لأول مكوك hexon البلازميد HVR1-صاحب KWAS-HVR5 6 / pH5S التي كتبها subcloning المنطقة hypervariable (HVR) 1 من hexon إلى البلازميد المكوك شيدت سابقا HVR5-صاحب 6 / pH5S، الذي كان له 6 العلامة دمجها في HVR5. تم توليفها هذه القطعة HVR1 DNA تحتوي على فيروس نقص المناعة البشرية حاتمة ELDKWAS. وكان 6 / pH5S HVR1-KWAS-صاحب HVR5-ثم خطي وتحويلها بالاشتراك مع خطي العمود الفقري البلازميد pAd5 / ΔH5 (GL)،لإعادة التركيب مثلي. هذا البلازميد معاد pAd5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 تم transfected في الخلايا لتوليد ناقلات فيروسية Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6. تم التحقق من صحة هذه متجه لياقة بدنية النوعية المشار إليها الفيروسي عيار البدني (VP / مل)، عيار المعدية (IP / مل)، والمقابلة VP نسبة / IP. كل من حاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6 العلامة كانت على قفيصة Ad5 المعرضة للسطح، واحتفظت استضداد حاتمة محددة من تلقاء نفسها. وأشار مقايسة تحييد قدرة هذا ثنائي التكافؤ ناقلات للتحايل على تحييد بواسطة الأمصال Ad5 إيجابية في المختبر. أظهر تحصين الفئران توليد القوي محددة مناعة الخلطية لحاتمة فيروس نقص المناعة البشرية وصاحب 6. وأشارت هذه الدراسة إثبات صحة المبدأ القائل بأن البروتوكول المرتبطة باستراتيجية مستضد قفيصة التأسيس يمكن الاستفادة عمليا للجيل اللقاحات Ad5 تنقلها عن طريق تعديل البروتينات قفيصة مختلفة. بل يمكن و هذا البروتوكولurther تعديل لتوليد اللقاحات تنقلها اتش نادر-المصلي.
اتش الإنسان (الإعلان) هو المتوسطة الحجم، غير يلفها الفيروسات مع قفيصة منواة لذوات الوجوه التي تحتوي على ضعف جينوم الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. الإعلان ينتمي إلى عائلة فيروسات غدانية، مع تصنيف إلى سبع مجموعات (A خلال G). تحتوي كل مجموعة الفيروس من الأنماط المصلية مختلفة. لقد منها، اتش المصلي 5 (Ad5) من مجموعة C الأكثر درس على نطاق واسع وتطبيقها على نطاق واسع للنهج تنقلها مثل العلاج الجيني واللقاحات.
وقد وضعت استراتيجية التحوير التقليدية وتطبيقها للتعديلات Ad5، الذي يتميز عن تشريد الفيروس الجينات في وقت مبكر مع الجين في المصالح، والتعبير تركيزا من الجينات من الاهتمام في مضيف. ومن الأمثلة على ذلك بناء pENV9 / Ad5hrΔE3 من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 3 (E3) مع مراجعة الجينات من قردي بفيروس نقص المناعة 1، وبناء AdCMVGag من خلال استبدال الجينات في وقت مبكر 1 (E1) مع الجين هفوة من نقص المناعة البشريفيروس (HIV) 2، وبناء أمريكا اللاتينية والكاريبي الإعلان Z عن طريق استبدال E1 مع أمريكا اللاتينية والكاريبي Z الجينات 3. وتطبيق واسع النطاق للاستراتيجية التحوير التقليدية على Ad5 يعتمد على الأسس الموضوعية التالية: مجموعة واسعة من المضيفين لAd5، والهندسة الوراثية الممكنة على الفيروس وانتشار الفيروس، والإقامة كبيرة من إدراج الجين الغريب وسلامة Ad5 4،5. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءات من العلاجات السريرية Ad5 تنقلها عن طريق استخدام هذه الاستراتيجية كان عقبة رئيسية، والتي تم تعيينها لتكون مرتبطة في المقام الأول مع Ad5 PEI، منذ Ad5 هو السائد حتى بين الغالبية العظمى من الأطفال والبالغين 4،6.
للتغلب على عقبة رئيسية من Ad5، فإن الهدف الأساسي هو وضع استراتيجية بديلة التحايل Ad5 PEI. المناعة الفطرية 7، حصانة التكيفية مثل تحييد الأجسام المضادة (يعتقل) 10/08 وCD8 + T استجابات الخلايا وقد ثبت أن 10 ضد Ad5 للمشاركةntribute إلى Ad5 PEI، مع Ad5 يعتقل الظهور للعب دور مهيمن في المساهمات في Ad5 PEI 10،11. وعلاوة على ذلك، Ad5 يعتقل الحواتم الهدف الموجود في البروتينات قفيصة، بما في ذلك hexon بروتين رئيسي والألياف وقاعدة بينتون. منها، hexon هو الهدف الرئيسي للAd5 يعتقل 8،11-13. وبناء على هذه النتائج، وقد تم عرض استراتيجية مبتكرة مستضد قفيصة التأسيس. هذه الاستراتيجية الجديدة تسلط الضوء على استبدال أو إدراج البروتينات من الفائدة على Ad5 البروتينات قفيصة، الأمر الذي يحول أو أقنعة الحواتم Ad5 تحييد، مما يؤدي إلى الاعتراف ينقص من جانب يعتقل وكفاءة الإدارات ناقلات Ad5. ومن الجدير بالذكر أن هذه الاستراتيجية التنافسية لأنه يمكن أن يساعد أيضا المضيفين يثير مناعة الخلطية قوية والمناعة الخلوية قوية من خلال تقديم مباشرة مستضدات المصالح لجهاز المناعة 4،14،15. وبناء على هذه الاستراتيجية، والاستنساخ الجزيئي والمؤتلف الانقاذ الإعلان ناقلات فيروسية يمكن تقسيم الهيكليةإلى أربع خطوات رئيسية: (أ) إعداد الجينات في المصالح جزء إما عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) أو التوليف؛ (ب) ربط جزء من الجينات في البلازميد المكوك الذي يحتوي على جزء الجينات في المصالح والأسلحة مثلي إلى العمود الفقري اتش. (ج) إعادة التركيب مثلي من قبل البلازميد المكوكية التي تحتوي على جزء الجينات في المصالح مع العمود الفقري البلازميد خطي pAd5 / ΔH5 (GL) 16-تحويل المشترك؛ (د) ترنسفكأيشن من خطي البلازميد الفيروسة الغدانية المؤتلف لانقاذ ناقلات الإعلان المؤتلف تدمج مع مستضدات من الفائدة.
قمنا بمد مجموعتنا والبعض الآخر هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان بديلة عن الإعلان تطوير لقاح ضد مسببات الأمراض المعدية تنقلها مختلفة. أبلغنا توليد متجه الإعلان المؤتلف الإعلان، وHVR1-خطابات الضمان، صاحب 6 -V3 من خلال دمج صاحب الموسومة HIV-1 مستضد V3 في لغة HVR1 من Ad5 hexon (hexon5). وأثار هذا متجه ولدت شارعاونج الاستجابة المناعية الخلطية محددة لحاتمة V3 4. أبلغنا أيضا تطوير Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 من خلال دمج HIV-1 غشاء المنطقة ectodomain الداني (MPER) في لغة HVR2 من hexon5 2. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت مجموعة الدكتور تشو فوائد هذه الاستراتيجية التأسيس الإعلان لتطوير المصلي الإعلان 3 (AD3) اللقاحات تنقلها، أي، توليد الفيروسية ناقلات R1SP70A3 من خلال دمج SP70 تحييد حاتمة من الفيروس المعوي 71 في HVR1 من AD3 hexon (hexon3). R1SP70A3 ولدت يعتقل قوي وإنتاج IFN-γ محددة لSP70 حاتمة، مما يؤدي إلى معدل عال من الحماية ضد الفيروس المعوي 71 تحديا 15.
لغرض مرجعية فنية، اتخذت دراستنا الاستفادة من استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس النوعية التركيز على جيل من ثنائي التكافؤ Ad5 ناقلات Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-صاحب 6 من خلال دمج مستضد HIV-1 في HVR1 لدا صاحب العلامة إلى HVR5 من hexon5. كما تم تقييم ناقلات فيروسية ولدت مناعيا. ويمكن استخدام استراتيجية مستضد قفيصة التأسيس نحو وضع نهج التطعيم Ad5 تنقلها ضد الأمراض المعدية المختلفة.
قد تقلصت تطبيق استراتيجية التحوير التقليدية على تعديل Ad5 لتطوير لقاحات ويرجع ذلك أساسا إلى عنق الزجاجة المرتبطة Ad5 PEI 4،6. هذا الاختناق يمكن أن تقلص جزئيا من خلال تطبيق البديل مستضد قفيصة التأسيس استراتيجية (الشكل 1A)، لأن هذه الاستراتيجية يمكن التهرب من …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح 5T32AI7493-20 و5R01AI089337-03. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |