Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için
Summary
Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.
Abstract
Stereotaktik enjeksiyon farelerde hedeflenen beyin bölgelerine yüksek titre lentiviruses sunmak için yararlı bir tekniktir. Lentivirüsler aşırı ifade eden ya da beyin dokusuna önemli bir zarar vermeden, nispeten odaklanmış bölgede demonte gen ekspresyonu ya. İyileştikten sonra, enjekte edilen fare gibi Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi çeşitli davranışsal görevler üzerinde test edilebilir. OFT fare bir roman açık alanda merkezinde geçirdiği süreyi ölçerek farelerde hareketlilik ve endişeli fenotip değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bir daha endişeli fare kontrollere göre yeni alanın ortasında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız. FST bir kova su içine yerleştirildiğinde fareler hareketsiz harcamak süreyi miktarının anti-depresif fenotip değerlendiriyor. Bir anti-depresif bir fenotipe sahip bir fare kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman hareketsiz geçirecek. Bu protokolün amacı, ster kullanmaktırdavranış testleri ile birlikte bir lentivirüs eotactic enjeksiyon hayvan davranışlarını modüle nasıl genetik faktörler değerlendirmek için.
Introduction
Bu genetik olarak manipüle edilmesi kolaydır, çünkü fare yaygın nörobiyolojisinde kullanılmıştır. Gen nakavt teknikleri her genetik faktör fare davranışlarını nasıl şekillendirdiğini araştırmacılar araştırmak için izin verir. Ayrıca, CRE-loxP sistemi doku için değerli bir araç sağlar ve farklı dokular içindeki gen fonksiyonu çalışma için araştırmacılar sağlar farelerde tip spesifik gen nakavt, Celi. 1 Bununla birlikte, uygulamada, CRE promoterlerin ekspresyon modelleri kontrol edilmesi zor olan ve bugüne kadar birçok kurulan CRE sürücüleri bölgeye özgü ifadesini elde değil. 2,3
Seçenek olarak ise, stereotaktik enjeksiyon yetişkin fare spesifik beyin bölgeleri hedef alan bir yöntemdir. CDNA veya shRNA eksprese genetik mühendisliği virüsleri enjekte ederek, gen ekspresyonunun bölgeye özgü modülasyonu elde edilebilir. Her bir farenin beyni boyutu değişir, ancak spesifik beyin bölgelerinde yer stereotaktik Coordi kullanılarak belirlenebilirkalça fare beyin kafatası üzerinde simgesel ayarlayın. En sık kullanılan görülecek Bregma, lambda ve interaural çizgi vardır. Beyin atlas elde edilen koordinatları kullanarak, her bir beyin bölgesinden 4 tam konumu antero-posterior (A / P), medyal lateral (M / L) ile tespit edilebilir, ve dorsal-ventral (D / V) 'den eksenleri Bregma / interaural hat kavşak. Enjeksiyonlar floresan mikroskobu ile teyit edilebilir ve böylece Tipik farelerin beyinlerinde enjekte virüsler ya kırmızı ya da yeşil floresan protein (RFP veya GFP) ile etiketlenmiş.
Farelerin Davranış değerlendirmeler psikiyatrik bozuklukların temel araştırma için özellikle gereklidir. Hastalarda psikiyatrik bozuklukların belirtileri genellikle anormal davranışları içerir. Bu insan davranışlarının bazıları evrimsel olarak korunmuş olan ve doğrudan taklit ve farede gözlenebilir. Örneğin, depresyon, davranışsal umutsuzluk ölçerek fare örnek alınabilir. Sık sık depresyon olan kişilerHiç yardımcı olacaktır yapmak bir şey sanki tr, sonunda intihara yol açabilir belirti hissediyorum. Kemirgenler, bu suyun bir havuzda yüzen karşı yüzme fare (vazgeçerek olarak görülüyor) süreyi ölçen Zorla Swim Testi (FST) kullanılarak modellenebilir. Bu paradigma, anti-depresanlar ile fenotip tahlisiye tarafından onaylanmıştır. Tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız hareketsiz anti-depresanlar almış 7,8,9 Fare. Başka bir davranış testi, Açık Alan Testi (OFT) farelerde lokomosyon değerlendirmek için tasarlanmıştır ve ayrıca farelerde endişeli fenotip analiz etmek için de kullanılabilir. 5,6 Bu test de yakın zaman fareler daha güvenli hissediyorum önermesine dayanır Bir roman açık alanda duvara. Onlar meraklı hayvanlar vahşi tip fareler sonunda, yeni bir ortam araştıracaktır. Ancak, alanın merkezinde daha az zaman harcama fare geçirme girişimlerini aşmak mümkün olmayacaktır olarak, fare anksiyete gösterirl korku yeni bir ortama getirdiği. Açık alanın merkezinde kaldığı zaman miktarı ile belirlenir olarak fare anksiyete, birçok psikiyatrik bozukluklarda mevcut olduğu, insanlarda klinik anksiyete, karşılaştırılabilir.
Davranış paradigmaları stereotaktik enjeksiyon kombinasyonu hedef beyin alanında, belirli bir genin ekspresyonunu değiştirmek için yeni bir yöntemdir. Fare davranışlar üzerinde modüle edilmiş gen ekspresyonu etkisi daha sonra tespit edilebilir. Tüm beyin nakavt aksine, bu yöntem, yalnızca spesifik beyin alanları hedef olarak özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, stereotaktik enjeksiyon, tipik olarak, yetişkin vahşi tip fare gerçekleştirilir, bu nedenle, endojen gen ekspresyonu gelişim aşamalarında içinde muhafaza edilmiştir. Gen gelişim embriyonik veya postnatal aşamasında hayatta kalmak için gerekli ise bu yöntem şaşırtmak etkisini önlemek olacaktır. Bir büyük sınırlama deneysel fareler Throug gitmek gerekir olduğunuH farelerin kafatası sahip olduğu bir invaziv cerrahi, açılacak. Ayrıca, gen modülasyon derecesi virüsün titresi ve verimlilik ile belirlenir. Virüs özel aletler gerektirir stereotaktik koordinatları kullanarak doğru bölgeye enjekte edilmesi gerekmektedir. Doğru enjeksiyon yerinde doğrulanması sadece otopsi tamamlanabilir.
Bu yöntem, daha önce çeşitli nörolojik hastalıklarda spesifik bir genin katılımını test etmek için kullanılmıştır. Örneğin, virüslerin aracılık ettiği bir RNAi (dopamin sentezlenebilir sağlar) Th genini hedef substantia nigra compacta'da enjekte edildi ve lokomotor davranışını analizi yapılmıştır. Bir başka çalışmada 10 ile ilgili olarak, fare davranışını değerlendirmek için bir lentivirüs susturulması DISC1 stereotaktik enjeksiyon kullanılan şizofreniye. DISC1 demonte yenilik tepki olarak artan hareketin neden (paralellikler şizofrenide pozitif belirtiler) ve daha fazla hareketsizlikFST. 11 Benzer bir şekilde, ek bir çalışma, 5-HT1B aşın dışa vurum, OFT artmış büzülmesi için bu yöntemi kullanan bir anti-anksiyete fenotipi ile tutarlı neden olduğunu buldu. 12 Stereotaksik enjeksiyonlar CRE-loxP farelerde rekombinasyonu azaltmak için cre virüsü sağlayabilir . Bu yöntem, selektif amigdala Y2 reseptörü ve stria terminalisin yatak çekirdeği silmek için kullanılmıştır. Davranış analizi üzerine, bu fareler gen merkezi amigdala silindi bir anti-depresif fenotip bulundu, ancak bulundu gen bazolateral amigdala veya stria terminalisin yatak çekirdeğinde silinmiş hiçbir fenotip. 13 Böylece, bu tekniği Hayvan davranışları üzerinde genetik etkisini araştırmak için benzersiz bir araç sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı stereotaktik enjeksiyonları üç faktöre dayanır: iğne (uç, canlı fare tutmak (bregma kesiştiği ve interaural hat üzerinde iğne ucu) koordinatları için doğru sıfır noktası ayarlama ve sıfır noktasına doğru derinlik ayarı Sadece) beyin dokusu dış dokunmadan. farelerin canlılığı önemlidir. Cerrahi hayatta kalma fare düzgün anestezi ve yeterli analjezik aldığı olduğundan emin yaparak destekli edilebilir. Ağrı ameliyat sonrası zayıf kazanımı önemli bir nedeni olduğu bili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
| Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
| Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
| Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
| Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
| Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
| Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
| Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
| Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
| Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
| Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
| Cloth | |||
| Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
| Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
| Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |
References
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
- Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
- Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
- Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
- Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
- Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
- Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
- Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
- Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
- Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
- Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
- Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
- Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
- Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
- Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
- Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
- Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
- Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
- Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
- Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
- Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).
