Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

La visualización de las células y las funciones celulares en órganos enteros o incluso organismos enteros ha sido de gran interés durante más de 50 años, incluyendo prácticamente todas las partes del cuerpo ^2. Por lo tanto, algunos de los primeros estudios que ya emplean intravital de imágenes del hígado ^3,4. Sin embargo, existen varias limitaciones al día en cuanto a imágenes de alta resolución estable a largo plazo del tejido hepático.

Debido a la posición anatómica del hígado en estrecho contacto con el diafragma y el tracto gastrointestinal ^5, el problema más común para formación de imágenes intravital microscópico es el movimiento debido a la respiración y, en menor medida, peristáltica del tracto intestinal ^6. En comparación con otros órganos sólidos, la cirugía del hígado es particularmente difícil. Debido a la estructura microvascular densa, la manipulación quirúrgica puede conducir a lesiones hemorrágicas masivas, alteración de la microcirculación ⁷ y también la activación de residente immune células tales como las células de Kupffer ^8. Por lo tanto, la fijación mecánica del tejido que se publica en otra parte ^6,9 es probable que interfiera con la formación de imágenes de microscopía intravital.

En un hígado sano, el 10-15% del volumen total de sangre reside dentro de la vasculatura del hígado, y el órgano recibe alrededor de 25% del gasto cardíaco en general ^10, haciendo que el órgano altamente susceptibles a cambios en la circulación (por ejemplo, fluctuaciones de la presión arterial ). Por lo tanto, las interrupciones en el flujo sanguíneo hepático debido a, por ejemplo, la tensión de cizallamiento, el desplazamiento, la lesión por la manipulación excesiva de los tejidos o la circulación centralizada dará lugar a alteraciones artificiales en el comportamiento migratorio de leucocitos, alteración de la oxigenación del hígado y, por tanto, un mayor daño del hígado, que afecta a la respuesta inmune del hígado, así como la preservación de órganos y el tiempo de vida general del animal.

Los primeros estudios microscópicos se basaron en mi epifluorescencia intravitalesmicroscopia, pero varias limitaciones técnicas tales como blanqueo foto y poca profundidad de penetración limitan el uso de esta técnica para obtener imágenes del hígado a largo plazo ^4,11,12. Con el desarrollo de la microscopía multifotónica en la década de 1990, las limitaciones de blanqueo foto o profundidad de penetración se resolvieron principalmente, ya que este nuevo método es técnicamente capaz de realizar estudios de imagen en prácticamente todos los órganos en virtud de situaciones de la vida real ^13-15. Sin embargo, los principales desafíos pendientes con respecto a las imágenes del hígado fueron: los movimientos de la respiración, la autofluorescencia del tejido hepático, que aseguran el flujo de sangre sin alteraciones en los sinusoides hepáticos, y proyección de imagen especialmente estables durante periodos de varias horas ¹⁶ más.

Aunque varios estudios abordaron la función y la migración de diversos leucocitos en el hígado ^17, por ejemplo, la ^NKT-18-20 células, células T ^21,22, los macrófagos del hígado ^23,24 o neutrófilos ^25, a largo plazo multifotónica mimágenes icroscopy aún no se había establecido con éxito, una tarea aún más difícil en los animales con enfermedad hepática aguda o crónica debido a los daños existentes y, por tanto, una mayor susceptibilidad a daños mayores ^26. Sin embargo, el monitoreo del comportamiento migratorio y la función celular de los leucocitos en el hígado en tiempo real permite a los nuevos conocimientos en su papel particular en la homeostasis del hígado y la enfermedad ^27.

El CXCR6 receptor de quimioquinas se expresa en varios subgrupos de linfocitos, incluyendo las células asesinas naturales (NK), las células NKT y algunas poblaciones de células T ^18,28. Estudios previos en ratones han indicado que CXCR6 y su CXCL16 ligando afín pueden controlar el patrullaje de las células NKT en sinusoides hepáticos durante la homeostasis. En consecuencia, el uso de ratones CXCR6.gfp (que lleva un knock-in de la proteína fluorescente verde [GFP] en el locus CXCR6) se ha descrito para investigar la migración de linfocitos en diversos órganos tales como el cerebro ²⁹y también el hígado ^18,20, mostrando aumento de la infiltración de células CXCR6.gfp sobre la inflamación.

Con el método proporcionado en este estudio era posible seguir estos procesos durante un largo período de tiempo en condiciones estabilizadas. El procedimiento basado multifotónica intravital permitió imagen que era altamente reproducible con perturbación mínima del animal y el órgano; optimizado para la supervivencia de los animales a largo plazo por una extensa evaluación que sigue un estricto control de la respiración y la circulación; y altamente flexible y fácil de adoptar también a otros órganos parenquimatosos como el riñón o el bazo.