एक तीक्ष्ण माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणी के साथ एक सामने आया Hippocampal तैयारी में तंत्रिका गतिविधि प्रचार
Summary
हम न्यूरॉन्स की सीए 1-सीए 3 सरणी को बरकरार रखता है, जो एक में इन विट्रो सामने आया हिप्पोकैम्पस विकसित किया है। मर्मज्ञ सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणी के साथ संयुक्त, तंत्रिका गतिविधि दोनों अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ झुकाव में नजर रखी जा सकती है। पूरे हिप्पोकैम्पस में प्रचार एक साथ दर्ज किया जा सकता है के रूप में इस विधि हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी से अधिक लाभ प्रदान करता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका गतिविधि नक्शा करने के लिए एक माइक्रो machined सरणी के साथ संयुक्त विट्रो फ्लैट हिप्पोकैम्पस तैयारी में एक नया तैयार करने के लिए एक विधि का वर्णन है। अनुप्रस्थ हिप्पोकैम्पस टुकड़ा तैयारी हिप्पोकैम्पस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अध्ययन करने के लिए सबसे आम ऊतक तैयारी है। एक अनुदैर्ध्य hippocampal टुकड़ा भी हिप्पोकैम्पस में अनुदैर्ध्य कनेक्शन की जांच करने के क्रम में विकसित किया गया था। इसकी मोटाई पर्याप्त ऑक्सीजन प्रसार की अनुमति देता है क्योंकि बरकरार माउस हिप्पोकैम्पस भी इन विट्रो में बनाए रखा जा सकता है। ऊतक के कुछ गुम या मुड़ा तो है लेकिन, जब से इन तीनों की तैयारी तंत्रिका प्रचार के लिए सीधी पहुँच प्रदान नहीं करते हैं। सामने आया बरकरार हिप्पोकैम्पस अनुप्रस्थ और इन विट्रो में हिप्पोकैम्पस में संकेत प्रसार की पूर्ण सीमा तक विश्लेषण करने के लिए ऊतक के लिए सीधी पहुँच के लिए एक फ्लैट विन्यास में अनुदैर्ध्य कनेक्शन दोनों प्रदान करता है। प्रभावी रूप से टी से तंत्रिका गतिविधि पर नजर रखने के आदेश मेंवह सेल परत, एक कस्टम निर्मित किया गया था सूक्ष्म इलेक्ट्रोड सरणी (PMEA) मर्मज्ञ बनाया है और सामने आया हिप्पोकैम्पस के लिए आवेदन किया। ऊंचाई में 200 माइक्रोन के 64 इलेक्ट्रोड के साथ PMEA गहरी माउस हिप्पोकैम्पस के अंदर तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड कर सकता है। एक सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी और PMEA का अनूठा संयोजन शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत के साथ हिप्पोकैम्पस के दो आयामी सीए 1-सीए 3 क्षेत्रों में गति और तंत्रिका गतिविधि के प्रसार की दिशा में अध्ययन करने के लिए एक नया में इन विट्रो उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
तंत्रिका संकेतों के तंत्रिका चालन या प्रचार को समझना मस्तिष्क 1-3 में सामान्य कार्य और रोग की स्थिति में दोनों तंत्रिका संचार के तंत्र का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। हिप्पोकैम्पस यह ऐसी स्मृति, और स्थानिक ट्रैकिंग के रूप में कई मस्तिष्क कार्यों में मौलिक भूमिका निभाता है और नाटकीय रूप से व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से 1,6 प्रभाव है कि कई रोग परिवर्तन में शामिल है के बाद से मस्तिष्क में सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन संरचनाओं में से एक है। हिप्पोकैम्पस एक जटिल संगठन दर्शाती है, इसकी संरचना के विभिन्न तत्वों को आसानी से पहचान की है और टुकड़ा तैयारी 4-6 में पहुँचा जा सकता है। हिप्पोकैम्पस की अनुप्रस्थ दिशा में, तंत्रिका गतिविधि दांतेदार गाइरस (डीजी), सीए 3, सीए 1 andsubiculum 4,5 शामिल है कि सप्ताह में तीन अन्तर्ग्रथनी मार्ग के माध्यम से प्रचार करने के लिए जाना जाता है। यह synaptic प्रसारण और axonal चालन संचार के लिए एक प्रमुख भूमिका निभा माना जाता है किइस अनुप्रस्थ सर्किट 4,6 में पर। हालांकि, तंत्रिका संकेत के प्रचार अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य दिशाओं 4,6 दोनों में जगह लेता है। इस हिप्पोकैम्पस पूरी तरह से प्रचार 4 के एक विशेष दिशा को अवलोकन की सीमा जो टुकड़ा तैयारी का उपयोग करके जांच नहीं की जा सकती कि निकलता है। अनुदैर्ध्य टुकड़ा अनुदैर्ध्य अक्ष 5 साथ axonal रास्ते जांच करने के लिए विकसित किया गया था। शोधकर्ताओं ने मुख्य रूप से अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य कुल्हाड़ियों क्रमश: 6 के साथ व्यवहार-विशिष्ट गामा और थीटा दोलनों मनाया है। इन कार्यों को अलग से अध्ययन किया गया है, फिर भी दोनों दिशाओं में एक साथ उपयोग इन कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां तक बरकरार हिप्पोकैम्पस तैयारी के विकास के साथ, यह कारण हिप्पोकैम्पस 4 की मुड़ा-संरचना करने के लिए पूरे ऊतक भर में प्रचार पर नजर रखने के लिए मुश्किल है। सामने आया हिप्पोकैम्पस पैक न्यूरॉन्स के लिए पहुँच प्रदान करता हैएक फ्लैट दो आयामी सेल परत 7,8 के रूप में।
दांतेदार गाइरस (डीजी) (चित्रा 1) खुलासा करके, हिप्पोकैम्पस, अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य कनेक्शन दोनों सीए 3 और सीए 1 दोनों से युक्त एक दो आयामी चादर में व्यवस्थित पिरामिड सेल परत के साथ बरकरार रहेगा, जिसमें एक आयताकार विन्यास के साथ एक चपटे आकार को गोद ले तंत्रिका प्रचार जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तंत्रिका ऊतक के एक फ्लैट टुकड़ा छोड़ने (चित्रा 2) 8। तंत्रिका गतिविधि तो व्यक्ति कांच pipettes, microelectrode सरणियों, उत्तेजक इलेक्ट्रोड, साथ ही वोल्टेज संवेदनशील रंजक (वी एस डी) 3,7,8 के साथ नजर रखी जा सकती है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों से आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग वोल्टेज सूचक प्रचार पैटर्न 9 ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
सामने आया हिप्पोकैम्पस नेटवर्क के फ्लैट विन्यास ऑप्टिकल विधि रिकॉर्डिंग के लिए, लेकिन यह भी एक microelectrode सरणी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। एमव्यावसायिक रूप से उपलब्ध सरणियों का कमजोर पक्ष फ्लैट या कम प्रोफ़ाइल इलेक्ट्रोड के साथ निर्मित कर रहे हैं और ऊतक स्लाइस और सभ्य न्यूरॉन्स 10-12 दोनों में तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्ड कर सकते हैं। न्यूरॉन्स की सोमा ऊतक में गहरी स्थित हैं के बाद से संकेतों एक अक्षुण्ण ऊतक से प्राप्त कर रहे हैं फिर भी, जब संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) कम हो जाती है। उच्च पहलू अनुपात के साथ microelectrode इलेक्ट्रोड सरणियों SNR में सुधार के लिए आवश्यक हैं।
इस आशय का एक मर्मज्ञ microelectrode सरणी (PMEA) हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया है, और सामने आया हिप्पोकैम्पस 7,13 में एक 20 माइक्रोन से व्यास और 200 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ 64 के spikes डालने से सीधे ऊतक में जांच करने की क्षमता प्रदान करता है । इस microelectrode सरणी वोल्टेज संवेदनशील डाई इमेजिंग की तुलना में उच्च SNR है और SNR एक प्रयोग 7,13 दौरान स्थिर बनी हुई है। सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी और PMEA के संयोजन निवेश करने के लिए एक नया तरीका प्रदान करता हैएक दो आयामी विमान पर तंत्रिका प्रचार आईगेट। इस तकनीक का उपयोग प्रयोगों पहले से ही तंत्रिका गतिविधि स्वतंत्र रूप से अन्तर्ग्रथनी या बिजली synapses के 7 का प्रचार कर सकते हैं जिससे हिप्पोकैम्पस में तंत्रिका संकेत प्रसार के तंत्र के बारे में महत्वपूर्ण परिणाम सामने आए है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हिप्पोकैम्पस के अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ कुल्हाड़ियों एक मर्मज्ञ microelectrode सरणी के साथ संयोजन में संरक्षित कर रहे हैं, जहां सामने आया हिप्पोकैम्पस तैयारी, के विकास, हिप्पोकैम्पस 7 में शरीर रचना विज्ञ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.
Materials
| desiccator jar | LABRECYCLERS Inc. | 5410 | Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. |
| A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus | N/A | N/A | A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. |
| Custom made tissue recovery chamber | N/A | N/A | Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF. |
| Straight Operating Scissors | Fisher Scientific | S17336B Medco Instruments No.:81995 | This scissors is used to decapitate the mice. |
| Integra Miltex Goldman-Fox Scissors | Fisher Scientific | 12-460-517 MILTEX INC No.:5-SC-320 | This scissors is used to cut the skull of the mice. |
| Miltex Hysterectomy Forceps |
Claflin Medical equipment | CESS-722033-00001 | This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain |
| Micro Spatula | Cardinal Health | This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. | |
| Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula | Cardinal Health | this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber. | |
| small paint brush | Lowe's | tem #: 105657 Model #: 90219 | The one with the smallest size in a normal paint brush package |
| Fire polished glass help tool | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass needle | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes. |
| Custom made glass tool with a metal wire loop | N/A | N/A | This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop. |
| Custom made glass solution dropper | N/A | N/A | This tool was made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end. |
| Custom made tissue anchor | N/A | N/A | Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. |
| Custom fabricated microelectrode array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Custom made filter and amplifiers circuits for the array | N/A | N/A | More detail about the array please refer to Kibler, et al, 2011. |
| Data acquisition processor 3400a | Microstar Laboratories | N/A | This is a complete data acquisition system with A/D converter. |
References
- Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
- Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
- Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
- Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
- Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
- Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
- Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
- Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
- Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
- Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
- Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
- Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
