Summary

Neural activité Propagation dans un hippocampe Préparation déplié avec un pénétrant Micro-réseau d'électrodes

Published: March 27, 2015
doi:

Summary

Nous avons développé un dépliée hippocampe in vitro qui préserve CA1-CA3 réseau de neurones. En combinaison avec le réseau de pénétration de micro-électrode, l'activité neuronale peut être contrôlée dans les deux orientations longitudinale et transversale. Cette méthode présente des avantages par rapport aux préparations de tranche de l'hippocampe que la propagation dans tout l'hippocampe peuvent être enregistrées simultanément.

Abstract

Ce protocole décrit un procédé pour la préparation d'une nouvelle préparation in vitro de l'hippocampe plat combiné avec une matrice de micro-usiné pour cartographier l'activité neuronale dans l'hippocampe. La préparation de l'hippocampe transversale de tranche est la préparation la plus courante de tissus pour étudier hippocampe électrophysiologie. Une tranche hippocampique longitudinale a également été élaboré afin d'enquêter sur les connexions longitudinales dans l'hippocampe. Les hippocampe de souris intactes peuvent également être maintenues in vitro parce que son épaisseur permet une diffusion adéquate de l'oxygène. Cependant, ces trois préparations ne fournissent pas un accès direct à la propagation de neurones depuis une partie du tissu est manquant ou plié. L'hippocampe intacte déplié fournit à la fois transversale et liaisons longitudinales dans une configuration à plat pour un accès direct au tissu d'analyser toute l'étendue de la propagation du signal dans l'hippocampe in vitro. Afin de surveiller efficacement l'activité neuronale de til couche de cellules, une coutume fait pénétrer réseau de micro-électrodes (PMEA) a été fabriqué et appliqué à l'hippocampe dépliée. Le PMEA avec 64 électrodes de 200 um de hauteur pourrait enregistrer l'activité neuronale au fond de l'hippocampe de souris. La combinaison unique d'une préparation hippocampique déplié et la PMEA fournit un nouvel outil in vitro pour étudier la vitesse et la direction de propagation de l'activité neuronale dans les régions bidimensionnelles CA1-CA3 de l'hippocampe avec un signal haute par rapport au bruit.

Introduction

La compréhension de la conduction nerveuse ou la propagation des signaux neuronaux est essentielle pour la détermination du mécanisme neuronal de la communication à la fois le fonctionnement normal et des états pathologiques dans le cerveau 1-3. L'hippocampe est l'une des structures les plus étudiés dans le cerveau, car il joue un rôle fondamental dans plusieurs fonctions cérébrales comme la mémoire, et le suivi spatial et est impliqué dans plusieurs changements pathologiques qui influent considérablement le comportement ainsi 1,6. Bien que, l'hippocampe présente une organisation complexe, les différents éléments de sa structure peuvent être facilement identifiés et accessibles dans la préparation de tranches 4-6. Dans le sens transversal de l'hippocampe, l'activité neuronale est connu pour se propager à travers la voie de tri-synaptique qui comprend le gyrus denté (DG), CA3, CA1 andsubiculum 4,5. On croit que la transmission synaptique et la conduction axonale jouent un rôle majeur pour communicatidans ce circuit transversal 4,6. Cependant, la propagation d'un signal neuronal a lieu dans les deux directions transversale et longitudinale 4,6. Cela implique que l'hippocampe ne peut pas être entièrement étudiée en utilisant des préparations de tranche qui limitent l'observation à une direction de propagation particulier quatre. La tranche longitudinale a été développé pour étudier les voies axonales long de l'axe longitudinal 5. Les chercheurs ont observé gamma et thêta oscillations spécifiques comportement principalement le long de la transversale et axes longitudinaux respectivement 6. Ces comportements ont été étudiés séparément, mais l'accès simultané à deux sens est crucial de comprendre ces comportements. Même avec le développement de la préparation de l'hippocampe intact, il est difficile de contrôler la propagation à travers le tissu en raison de l'ensemble de la structure repliée de l'hippocampe 4. L'hippocampe dépliée permet d'accéder aux neurones emballéssous une forme d'une couche de cellules à deux dimensions 7,8 plat.

Par déplier le gyrus denté (DG) (figure 1), l'hippocampe adopte une forme aplatie avec une configuration rectangulaire dans laquelle les deux transversal et liaisons longitudinales restent intactes avec la couche de cellules pyramidales disposé dans une feuille à deux dimensions contenant à la fois CA3 et CA1, laissant un morceau plat de tissu neural qui peut être utilisée pour étudier la propagation neural (figure 2) 8. L'activité neuronale peut alors être contrôlée avec des pipettes individuelles de verre, des réseaux de microélectrodes, des électrodes de stimulation, ainsi que des colorants sensibles à la tension (VSD) 3,7,8. En outre, l'indicateur de tension génétiquement codé à partir de souris transgéniques peut être utilisé pour suivre le motif de propagation neuf.

La configuration à plat du réseau hippocampique déplié est bien adapté pour enregistrement optique de la méthode mais aussi pour une matrice de microélectrodes. Most des tableaux disponibles dans le commerce sont fabriqués avec un profil plat ou à faible électrodes et peut enregistrer l'activité neuronale dans les deux tranches de tissu et des neurones en culture de 10 à 12. Cependant, le rapport signal-sur-bruit (SNR) diminue lorsque les signaux sont obtenus à partir d'un tissu intact depuis le soma des neurones sont situés plus profondément dans le tissu. matrices d'électrodes de microélectrodes avec des rapports d'aspect élevés sont nécessaires pour améliorer le SNR.

A cet effet, un réseau de microélectrodes de pénétration (PMEA) a été développé dans notre laboratoire, et fournit la capacité de la sonde directement dans le tissu 64 par l'insertion des pointes d'un diamètre de 20 um et 200 um de hauteur dans l'hippocampe 7,13 dépliées . Ce réseau de microélectrodes a SNR plus élevé par rapport à la formation d'image de colorant sensibles à la tension et le SNR reste stable lors d'une expérience 7,13. La combinaison de la préparation de l'hippocampe déplié et la PMEA fournit une nouvelle façon d'investirIgate la propagation neural sur un plan à deux dimensions. Des expériences utilisant cette technique ont déjà donné des résultats significatifs sur les mécanismes de propagation du signal neuronal dans l'hippocampe lequel l'activité neuronale peut se propager indépendamment des synapses synaptiques ou électriques 7.

Protocol

NOTE: Animal protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'université. Souris CD1 des deux sexes à l'âge de P10 à P20 sont utilisés dans cette étude. 1. Les solutions pour la chirurgie expérimentale et enregistrement Préparer normale tampon liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) contenant (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH 2 PO 4 1,25, MgSO 4 2, N…

Representative Results

Les données présentées sur les figures ici ont été enregistrés dans la préparation de l'hippocampe dépliée avec la 4-AP (100 pM) aCSF ajoutée pendant l'incubation du tissu dans la chambre d'enregistrement à la température ambiante (25 ° C). Normalement l'activité commence dans 5 minutes, mais dans certains tissus de l'hippocampe des animaux plus âgés, il peut prendre plus de temps. Le 4-décharge neuronale induite par des AP observé avec la PMEA est le même que précédemment rappor…

Discussion

Le développement de la préparation de l'hippocampe déplié, où les axes longitudinaux et transversaux de l'hippocampe sont conservés en combinaison avec une matrice de microélectrodes pénétrant, fournit un outil puissant pour étudier les connexions d'anatomie ou la propagation de neurones dans l'hippocampe 7. Cette procédure se déroule est également applicable pour l'étude de l'hippocampe chez des souris adultes. Des études récentes avec cette préparation ont montré qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health (National Institute of Neurological Disorders and Stroke) Grant 1R01NS060757-01 and by the E.L. Lindseth endowed chair to Dominique M. Durand. We thank Dr. Andrew M. Rollins’ laboratory for the help on the OCT imaging.

Materials

desiccator jar LABRECYCLERS Inc. 5410 Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use. 
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus N/A N/A A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it. 
Custom made tissue recovery chamber N/A N/A Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors Fisher Scientific S17336B                                            Medco Instruments No.:81995  This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors Fisher Scientific 12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320 This scissors is used to cut the skull of the mice. 
Miltex
Hysterectomy Forceps
Claflin Medical equipment CESS-722033-00001 This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula Cardinal Health This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber. 
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula Cardinal Health this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush Lowe's tem #: 105657                  Model #: 90219 The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop N/A N/A This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper N/A N/A This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor N/A N/A Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator. 
Custom fabricated microelectrode array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Custom made filter and amplifiers circuits for the array N/A N/A More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011. 
Data acquisition processor 3400a Microstar Laboratories N/A This is a complete data acquisition system with A/D converter.

References

  1. Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
  2. Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
  3. Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
  4. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  5. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  6. Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
  7. Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  8. Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
  9. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
  10. Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
  11. Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
  12. Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
  13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
  14. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
  15. Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
  16. Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
  17. Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).
check_url/52601?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Zhang, M., Kibler, A. B., Gonzales-Reyes, L. E., Durand, D. M. Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array. J. Vis. Exp. (97), e52601, doi:10.3791/52601 (2015).

View Video