Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar<em> Toxoplasma gondii</em> genes importantes celular para Resistance to-IFN-γ Dependente Immunity Autónoma

Toxoplasma gondii (T. gondii) é uma intracelular obrigatório, patógeno protozoários. É o agente causador da toxoplasmose, um perigo para a saúde em indivíduos imunocomprometidos. É também o sistema modelo para outros agentes patogénicos apicomplexan que infectam os seres humanos, incluindo o Cryptosporidium e Cyclospora. A toxoplasmose é mais comumente adquirida através da ingestão de alimentos ou água contaminados com a bradyzoite ou oocisto fase do parasita. Após a ingestão, estes estágios converter ao palco taquizoíto do parasita que se replica dentro das células hospedeiras e divulga sistemicamente. As células T, IFN-γ e, em menor grau, o óxido nítrico ^1-4, são importantes para o controlo de infecção, mas não são capazes de eliminar a doença, como uma proporção de taquizoítos converter para a fase bradyzoite que estão protegidas no interior dos cistos de tecido resultando numa infecção crónica de longa duração. De facto, não há terapias eficazes contra o cisto s crónicatagem da doença. Toxoplasmose grave é na maioria das vezes, devido à reativação da infecção persistente, com o estágio bradyzoite do parasita converter de volta para o palco rapidamente replicar característica taquizoíto de infecção primária e aguda.

Sobrevivência no início da face da resposta imune inata é importante para permitir que o parasita para alcançar números suficientes de parasitas, assim como para alcançar locais distais, para permitir o estabelecimento de infecção crónica. T. gondii evoluiu estratégias para combater os mecanismos de defesa do hospedeiro que provavelmente contribuem para a sua capacidade de se replicar e propagar no início da infecção. Em primeiro lugar, T. gondii constitui um PV original durante a invasão do parasita que é largamente segregado a partir dos processos de endocitose e exocíticas da célula hospedeira em comparação com outros patogénios intracelulares ^5-9. Além disso, como todos bem sucedidos patógenos intracelulares T. gondii altera a sua célula hospedeira para criar um ambiente permissivo fou crescimento. Isso inclui a expressão do gene da célula hospedeira reprogramação alterando fatores de transcrição da célula hospedeira, incluindo os que são importantes para regular a ativação de células ^10-15. ROP16 ^16-19, GRA15 ^{20, 21} e GRA16 GRA24 ²² tenham sido mostrados para ser importante na regulação da resposta de transcrição e de sinalização celular em cascata de células hospedeiras infectadas com T. gondii. Estudos recentes utilizando cruzamentos genéticos entre linhagens do parasita com fenótipos distintos têm sido altamente produtivo na identificação de genes do parasita que fundamentam traços genótipo-dependente de parasitas, incluindo a evasão de imunidade relacionada GTPases (IRGs) ^16,19,23-26. Em ratinhos, relacionadas com a imunidade GTPases (IRGs) são críticos para o controlo do Tipo II e III genótipos do parasita enquanto o tipo I muito virulento genótipos desenvolveram mecanismos para escapar às IRGs murino. No entanto, também é claro que o parasita se desenvolveram mecanismos para escapar meios antimicrobianares em adição aos IRGs e que alguns destes mecanismos pode ser conservado entre os genótipos de parasitas ^27,28. Além disso, muito pouco se sabe sobre os mediadores críticos da imunidade celular autónoma contra T. gondii durante toxoplasmose humana. Genes dos parasitas importantes para a resistência aos mediadores da imunidade celular autónoma pode também ser importante para a sobrevivência durante taquizoíto para bradyzoite conversão que também pode ser desencadeada por respostas imunitárias do hospedeiro. Por exemplo, o óxido nítrico em níveis elevados pode suprimir a replicação do parasita em macrófagos infectados, mas também pode estimular a taquizoíto bradyzoite conversão resultando na produção de cisto ^30-32.

ToxoDB é um banco de dados de genômica funcional para T. gondii, que funciona como um recurso crítico para o campo em termos de fornecimento de informações de seqüência do genoma do parasita e acesso a dados em larga escala genômica publicados e não publicados, incluindo anotações da comunidade, exp gene dados ression e proteômica ^33. Semelhante a muitos patogénios protozoários, a maior parte do genoma é constituído por genes hipotéticos sem informações disponíveis, com base na homologia de genes para fornecer informações sobre as suas funções potenciais. Assim, a genética para a frente é uma ferramenta poderosa para identificar genes do parasita novos importantes para a evasão imune, conversão de cisto e outras funções críticas para parasita patogenia, bem como para a conversão entre diferentes estágios de desenvolvimento. Uma resistência adicional da genética para a frente é que ele pode ser usado como uma abordagem relativamente não enviesada para interrogar o parasita como para os genes que são importantes para tarefas específicas em patogénese, incluindo a evasão imune e formação de quistos. As recentes melhorias na próxima geração de sequenciamento para perfilamento mutacional fizeram-lhe um método de escolha para identificar os genes do parasita responsáveis ​​de estudos de genética para a frente usando mutagênese tanto química e insercional ^34-37.

ntent "> É importante identificar vulnerabilidades no T. gondii que podem ser explorados para reforçar a eficácia das células imunitárias mecanismos autónomos contra o parasita particularmente aqueles que possam também ser activos contra o estágio de cisto resistente. Com este objectivo, in vitro murino infecção de macrófagos e modelo de ativação foi desenvolvido para identificar mutações no parasita que prejudicar especificamente T. gondii aptidão após a ativação dos macrófagos infectados, mas não em macrófagos ingênuos. Essa tela de macrófagos foi usado para interrogar uma biblioteca de T. gondii mutantes de inserção, a fim de, em última instância identificar genes de T. gondii importantes para a resistência ao óxido nítrico ^27,28. O isolamento de um painel de mutantes de T. gondii com resistência diminuída à activação de macrófagos infectados, particularmente uma sensibilidade marcada ao óxido nítrico, comprovou a utilidade da tela para identificar genes do parasita importantes para a resistênciaa mediadores da imunidade celular autónoma do que os outros mecanismos de resistência descritos para os ²⁸ IRGs murino. Mutagénese de inserção tem vantagens em relação a mutagénese química em termos de geração de um número limitado de mutações aleatórias em cada clone parasita e, em teoria, mais fácil identificação do local da mutação. No entanto, a identificação do sítio genómico de inserção no plasmídeo T. Os mutantes de inserção gondii, na prática, tem sido surpreendentemente difícil em muitos casos ^37. A inserção de um plasmídeo em um gene é também susceptível de perturbar a função de um gene, em contraste com a mutagénese química que tipicamente resulta em alterações de um só nucleótido. No entanto, a mutagénese química com ou N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou sulfonato ethylmethane (EMS) pode oferecer uma maior capacidade de analisar um maior parte do genoma do parasita, em comparação com mutagénese de inserção, uma vez que cria vários polimorfismos de um único nucleótido ( estimado em 10 -100) por ³⁴ mutante, De 38 anos. Além disso, avanços recentes na caracterização do genoma inteiro tornou possível a utilização de sequenciação próxima geração para identificar os genes candidatos mais prováveis ​​responsáveis ​​pelo fenótipo identificado de um parasita mutado ^34,38. Independentemente da abordagem de mutagénese, a confirmação da função do gene parasita na resistência a activação de macrófagos em última análise requer a deleção do gene de complementação e para cumprir os postulados de Koch molecular.

A capacidade para dissecar a função de um gene através da manipulação genética de tanto o parasita e o macrófago é importante como muitos dos genes identificados através da genética para a frente em T. gondii, bem como outros agentes patogénicos, são ainda caracterizadas como genes hipotéticos com pouca ou nenhuma homologia de sequência com outras proteínas com funções conhecidas. O papel actual descreve uma abordagem geral que pode ser usado para identificar se o gene interrompido num mutante é importante para a resistência a um ou conhecidadesconhecido mediador da imunidade autônomo celular. A análise inicial do hospedeiro factores antimicrobianos é realizada através da avaliação da sobrevivência de tipo selvagem e mutantes de parasitas em macrófagos dos murganhos do tipo selvagem versus pacientes com deleções de genes específicos em indutível da sintase do óxido nítrico (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidase), e GTPases específicas relacionadas com a imunidade (IRGs). Isso vai determinar se os genes do parasita identificados são importantes para a resistência ao óxido nítrico, intermediários reativos de oxigênio ou relacionadas com a imunidade GTPases ^28, respectivamente, ou se um mecanismo imunológico desconhecido está envolvido. A activação de macrófagos infectados com tanto IFN-γ e LPS, descritos no protocolo de corrente, resulta primeiramente no isolamento de genes de parasitas importantes para a resistência ao óxido nítrico ^28. A utilização de agentes farmacológicos que induzem o óxido nítrico na ausência de activação de macrófagos (dadores de óxido nítrico) confirmou que a maioria dos genes identificados, foram importantes para a resistência ao óxido nítrico em vez de óxido nítrico em combinação com mediadores adicionais associados com a activação de macrófagos ^28.

Passo um e dois descrevem uma tela genética para a frente destinada a isolar mutantes do parasita com um defeito de fitness a seguir à activação de macrófagos derivados da medula óssea infectadas in vitro. O primeiro passo descreve uma análise de titulação da dose para determinar empiricamente uma dose de LPS e IFN-γ a ser usado para a activação de macrófagos, que reduz a replicação do parasita, mas não inibe completamente a replicação do tipo selvagem T. gondii estirpe parental que é usada para a criação da biblioteca de mutantes do parasita. Passo dois descreve o rastreio genético para a frente dos clones mutantes em macrófagos em placas de 96 poços. Passo três descreve uma abordagem para confirmar o fenótipo de cada mutante identificado na triagem das placas de 96 poços e para avaliar se o defeito em cada mutante afecta a sobrevivência do parasita, replicação,ou a produção de cisto em resposta à activação de macrófagos. Passo quatro descreve a utilização de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos com deleções em vias antimicrobianos específicos para identificar os mediadores imunes ao qual o parasita mutante é especificamente susceptíveis. Passo cinco descreve uma abordagem para determinar se um parasita mutante é também comprometida para patogénese in vivo como avaliado pela produção de quisto nos cérebros de ratos infectados.