Summary

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup> +</sup> CD45RB<sup> גבוה</sup> תאי T לעכברי immunodeficient

Published: April 21, 2015
doi:

Summary

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Abstract

יש מודלים של בעלי חיים רבים ושונים זמינים ללימוד פתוגנזה של מחלות בבני אדם מעי דלקתיות (IBD), כל אחד עם יתרונות משלה וחסרונות. אנו מתארים כאן מודל קוליטיס ניסיוני שהוא ביוזמת העברת מאמצת של תאי טחול syngeneic CD4 + T CD45RB הגבוה לעכברי נמען חסרי T ו- B תא. אוכלוסיית תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB שמורכבת בעיקר של תאי מפעיל נאיביים היא מסוגלת גרימת דלקת מעיים כרונית, דומה מאוד להיבטים מרכזיים של IBD האנושי. שיטה זו ניתן להשפיע ללמוד היבטים של תחילת מחלה והתקדמות. בנוסף ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את הפונקציה של מולדת, מסתגל, ואוכלוסיות תאים חיסוני רגולציה, ואת התפקיד של חשיפות סביבתיות, כלומר, החיידקים, בדלקת מעיים. במאמר זה אנו מדגימים את המתודולוגיה לגרימת דלקת המעי הגס עם פרוטוקול צעד-אחר-צעד. inc זהלרכב וידאו הדגמה של היבטים טכניים מפתח נדרשו לפתח מודל העכברי של קוליטיס הניסיוני למטרות מחקר בהצלחה.

Introduction

The inflammatory bowel diseases (IBD) Crohn’s disease and ulcerative colitis result from an incompletely defined and complex interaction between host immune responses, genetic susceptibility, environmental factors, and the enteric luminal contents1. Recent genome-wide association studies report associations between immune cell regulatory genes and IBD susceptibility2,3. Both innate and adaptive immune cell intrinsic genes are represented in these studies, indicating a central role for these cell populations in IBD pathogenesis.

There currently exist more than 50 animal models of human IBD. While no one model perfectly phenocopies human IBD, many are useful for studying various aspects of human disease, including disease onset and progression and the wound-healing response. In the method described here, intestinal inflammation is initiated with syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cell adoptive transfer into T and B cell deficient recipient mice4. The CD4+CD45RBhigh T cell population contains mainly naïve T cells primed for activation that are capable of inducing chronic small bowel and colonic inflammation. This method allows the researcher to modify key experimental variables, including both innate and adaptive immune cell populations, to answer biologically relevant questions relating to disease pathogenesis. Additionally, this method provides precise initiation of disease onset and a well-characterized experimental time course. This permits the kinetic study of clinical features of disease progression in mice. Intestinal inflammation induced by this method shares many features with human IBD, including chronic large and small bowel transmural inflammation, pathogenesis driven by cytokines such as TNF and IL-12, and systemic symptoms such as wasting5. Thus, it is an ideal model system for studying the pathogenesis of human IBD.

The method here describes in detail the protocol for inducing experimental colitis by adoptive transfer of CD4+CD45RBhigh T cells into Rag1-/- mice. We discuss key technical steps, expected results, optimization, and trouble-shooting. We address the required elements for the successful development of this murine model of intestinal inflammation for research purposes.

Protocol

הערה: ודא שכל הפרוטוקולים של בעלי החיים שאושרו על ידי ובעמידה בבעלי חיים מוסדי טיפול ושימוש ועדת תקנות (IACUC) והמדריך של המועצה הלאומית למחקר לטיפול והשימוש בחי מעבדה. עכברי תורם יכולים להיות זכר או נקבה, אבל עכברי נמען צריכים להיות גבר. אם המקבלים נשיים הם לש?…

Representative Results

כ 10 x 10 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מ -10 טחולים ממבוגרי C57BL / 6 עכברים תורמים באופן מהימן מבודדים. מספר זה ישתנה בהתאם לגיל והמתח של עכבר התורם ומיומנותו של החוקר. כאשר 4 x 10 5 C57BL / 6 תאי T מסוג CD4 + הגבוה CD45RB מועברים לתוך C57BL Rag1 / 6 – / – עכברי נמען, סי…

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד-אחר-צעד גרימת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברת מאמצת של תאי CD4 + CD45RB + T לעכברי immunodeficient. אנחנו השתמשנו טחולי C57BL / 6 תורם וRag1 syngeneic – / – עכברי נמען, אם כי זנים אחרים (למשל, BALB / ג, 129S6 / SvEv, סוכרת שאינן סובל מהשמנת יתר (NOD)) ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי אמריקאי Gastroenterological Association (AGA) מחקר חוקרי פרס וקרוהן וקוליטיס קרן של אמריקה (CCFA) פיתוח קריירה פרס (לSZS), DK089692 F30 NIH NIDDK (לECS), ואוניברסיטת צפון מרכז קרוליינה לביולוגיה במערכת העיכול וDK34987 P30 מחלת גרנט (היסטולוגיה Core). מתקן UNC cytometry זרימת Core נתמך בחלקו על ידי NCI מרכז Core תמיכת גרנט (P30CA016086) למרכז לסרטן UNC Lineberger. אנו מודים ללוק B. Borst מState College אוניברסיטת צפון קרוליינה לרפואת וטרינרית על עזרתו עם ניתוח ואימונוהיסטוכימיה histopathological.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10x PBS Gibco 14200075
12x75mm round-bottom tube Falcon 352052
15 ml conical Corning 430790
26g x 3/8 Needle BD Biosciences 305110
50 ml conical Corning 430828
70 um Cell Strainer Fisherbrand 22363548
BD IMagnet BD Biosciences 552311
β-mercaptoethanol Thermo Scientific 35602
CD4-FITC IgG2b eBioscience 11-0041
CD45RB-PE IgG2a BD Pharminogen 553101
Complete Media RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME
FACS tube + strainer BD Falcon 352235
Glass Microscope Slides Fisherbrand 12550A3
Heat-inactivated FBS Gemini 100-106
Labeling Buffer 1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer 0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP Beckman Coulter
Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set – DM BD Biosciences 558131
Mouse IgG2a-PE BD Pharminogen 553457
Mouse IgG2b-FITC eBioscience 11-4732
Pasteur pipet Fisherbrand 13-678-20D
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning Cellgro 30-002-CI
Petri Dish Fisherbrand 875713
Pure Ethanol 200 Proof Decon Labs 2705-HC
RPMI-1640 Gibco 11-875-093
Syringe BD Biosciences 309597
Trypan blue Corning Cellgro 25-900-CI
Wash Media RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME

References

  1. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  2. Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).
  3. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  4. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).
  5. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).
  6. Ma, B. W., et al. Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice. PLoS One. 7 (10), e47416 (2012).
  7. Read, S., Powrie, F. Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).
  8. Maillard, M. H., et al. The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells. J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).
  9. Hegazi, R. A., et al. Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway. J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).
  10. Kole, A., et al. Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis. J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).
  11. Kobayashi, T., et al. NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis. J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).
  12. Steinbach, E. C., et al. Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis. J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).
  13. Kobayashi, T., et al. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).
  14. Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells. Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).
  15. Powrie, F., et al. Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4. T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).
  16. Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).
  17. Rogers, G. B., et al. Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice. Sci Rep. 4, 5437 (2014).
  18. Fukata, M., et al. The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease. J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).
  19. Kurtz, C. C., et al. Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).
  20. Naganuma, M., et al. Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis. J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).
  21. Ranatunga, D. C., et al. A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis. J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).
  22. Srikrishna, G., et al. Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa. B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).
  23. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).

Play Video

Cite This Article
Steinbach, E. C., Gipson, G. R., Sheikh, S. Z. Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (98), e52533, doi:10.3791/52533 (2015).

View Video