Génération de stimulateur cardiaque murin agrégats de cellules fondées sur la ES-Cell-programmation en combinaison avec MYH6-promoteur-sélection
Summary
Ce protocole décrit comment produire fonctionnel sinus nodal tissu de cellules souches pluripotentes (PSC) murins. T-Box3 (TBX3), plus la surexpression cardiaque myosine-chaîne lourde (MYH6) sélection par antibiotique promoteur conduit à des agrégats de cellules de stimulateur de haute pureté. Ces "induit-sino-auriculaire-organismes" ("iSABs») contiennent plus de 80% de cellules de stimulateur cardiaque, montrent des taux de battement très augmenté et sont capables d'arpenter myocarde ex vivo.
Abstract
Traitement de la "maladie du sinus" est basé sur les stimulateurs cardiaques artificielles. Ceux-ci portent des risques tels que l'insuffisance et les infections batterie. En outre, ils ne ont pas la réponse hormonale et la procédure globale est coûteux. "Pacemakers biologiques" générés par les CSP peuvent devenir une alternative, mais le contenu typique des cellules pacemaker en corps embryoïdes (EBS) est extrêmement faible. Le protocole décrit combine «programmation avant» du PSC murins via le nœud sinusal inducteur TBX3 avec la sélection à base d'antibiotiques MYH6-promoteur. Cela donne agrégats de cardiomyocytes cohérentes> 80% de cellules pacemaker physiologiquement fonctionnels. Ces «induits-sino-auriculaire-organismes" ("iSABs") sont contractant spontanément à des fréquences encore non atteints (400-500 bpm) correspondant à des cellules ganglionnaires isolées de coeurs de souris et sont capables d'arpenter myocarde murin ex vivo. En utilisant le protocole décrit des sinus de haute puretécellules individuelles nodaux peuvent être générés qui par exemple peut être utilisé pour les tests in vitro de médicaments. En outre, les iSABs générés selon ce protocole peuvent devenir une étape cruciale vers l'ingénierie du tissu cardiaque.
Introduction
Le terme «maladie du sinus» résume plusieurs maladies conduisant à la détérioration du système de stimulateur cardiaque. Il comprend pathologique, bradycardie symptomatique des sinus, bloc sino-auriculaire, arrêt sinusal ainsi que le syndrome de tachycardie-bradycardie. Ainsi, une «maladie du sinus" est souvent accompagnée par des maladies cardiaques généraux comme une maladie cardiaque ischémique, cardiomyopathies ou une myocardite. À l'heure actuelle, les approches thérapeutiques basées sur l'implantation de stimulateurs électriques. Toutefois, cela va de pair avec un certain nombre de risques tels que les infections et une panne de batterie. Dans l'ensemble, l'incidence des complications est encore très élevé chez les patients ayant implanté un stimulateur artificiel. En outre, par opposition au stimulateur endogène, ces dispositifs ne répondent pas à la stimulation de l'hormone.
Une alternative avenir peut compter sur la disponibilité de «pacemakers biologiques" pour lequel PSC pourraient servirune source cellulaire appropriée et qui serait aussi très utile pour les tests in vitro de médicament. Pourtant, un problème majeur réside dans l'apparition très rare de cellules ganglionnaires de sinus dans les corps embryoïdes (EBS) – ce généralement ne dépasse pas ~ 0,5% 1.
Auparavant, il a été montré que la "programmation avant" vers des sous-types spécifiques de cardiomyocytes est réalisable via la surexpression des facteurs premiers distincts cardiovasculaires de transcription tels que le facteur 1 (MesP1) spécifiques à-mésoderme postérieur et NK2 transcription liée, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Pour la taille et la fonction du noeud sino-auriculaire (SAN) normale, la T-box facteur de transcription TBX3 est crucial, qui a été montré pour lancer le programme génique du stimulateur et à contrôler la différenciation de la SAN 4. Bien que cette renforcée l'apparition de cellules de stimulateur cardiaque fonctionnelle, la teneur encore ne dépasse pas environ 40% dans l'ensemble de la population de cellules cardiomyocytic.
Par conséquent, une étape de sélection par antibiotique à base supplémentaire MYH6-5 promoteur a été introduit par nous. Cela conduit finalement à des agrégats de cardiomyocytes encore non observées ("organismes induits sino-auriculaire;" iSABs ») qui présentent des fréquences battant fortement augmenté (> 400 bpm) in vitro, pour se rapprochant de celles d'un cœur murin et comparable à cultivées in vitro la première fois sinus cellules ganglionnaires isolées d'un cœur murin 6. Sous l'administration Isoprénaline même fréquences battant de 550 bpm sont atteints. Notamment, iSABs se composent de plus de 80% de cellules nodales fonctionnels évidents de la vaste physiologique analyses 7. Récemment, plusieurs approches pour générer des sinus cellules nodales utilisant reprogrammation directe 19, marqueurs de surface 14 ou traitement pharmacologique avec de petites molécules 16,17 ont été décrits. Pourtant, aucune de ces méthodes conduit à une telle pureté élevé de cellules pacemaker et en battant des fréquences proches de la souris, ill'art comme observé dans iSABs.
De plus, dans un modèle ex vivo de cultivées tranches ventriculaires de souris adultes qui ont perdu leur activité de battements spontanés, les iSABs sont capables de se intégrer dans le tissu de la tranche, restant ainsi spontanément actif et robuste stimulation les tranches cardiaques à des contractions 7. Un protocole détaillé pour la génération de ces iSABs est décrite dans le présent document.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité à produire des cellules souches du stimulateur cardiaque cellulaires dérivées peuvent permettre la reconstitution du rythme cardiaque approprié dans le sens de "stimulateurs biologiques". De même, les tests de médicaments in vitro bénéficiera de leur disponibilité. PSC peut donner lieu à ne importe quel type de l'organisme d'un mammifère y compris cardiomyocytes avec des propriétés de cellules pacemaker 8,9,10,11,12,13 cellulaire. Cependant, généralement les popul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
| Iscove's liquid medium with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0465 |
| DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine | Biochrom AG | FG 0435 |
| CLS type IV, CLS IV | Biochrom AG | C4-22 |
| Non-essential amino acids | Biochrom AG | K 0293 |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Biochrom AG | L 0473 |
| G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile | Biochrom AG | A 2912 |
| Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile | Brand | 703409 |
| Accutase | eBioscience,Inc. | 00-4555-56 |
| Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette | Eppendorf | 4861000155 |
| Falcon Cell Strainer 40µm | Falcon | 352340 |
| Penicillin/Streptomycin | GE Healthcare | P11-010 |
| Petri Dishes | Greiner BioOne | 663102 |
| DPBS without Ca and Mg | PAN-Biotech | P04-36500 |
| Fetal bovine serum | PAN-Biotech | P30-3302 |
| Leukemia inhibitory factor | Phoenix Europe GmbH | LIF-250 |
| Quadratic petri dishes | Roth | PX67.1 |
| Gelatin from cold water fish skin | SigmaAldrich | G7765 |
| 2-Mercaptoethanol | SigmaAldrich | M3148 |
| 1-Thioglycerol | SigmaAldrich | M6145 |
| Tissue culture dishes | TPP | 93100 |
| Tissue culture flask | TPP | 90076 |
| Tissue culture test plates (24 well) | TPP | 92424 |
References
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