Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
高清晰度傅立叶变换红外(FT-IR)光谱成像是一个新兴的方法,得到具有关联生物化学信息的图像。组织的FT-IR成像是基于中红外的不同区域由不同的化学键( 例如,C = O,CH,NH)内的细胞或组织,然后可与存在和组合物吸收的原理生物分子( 例如,脂质,脱氧核糖核酸,糖原,蛋白质,胶原蛋白)。在的FT-IR图像,所述图像内的每个像素包括一个完整的红外光谱(IR),可以给信息上,然后可以利用对细胞类型或疾病的类型分类的细胞的生化状态。在本文中,我们将展示:如何从使用FT-IR系统的人体组织获得的红外图像,如何修改现有的仪器,使高清晰度成像能力,以及如何可视化FT-IR图像。然后,我们提出的FT-IR一些应用为病理使用肝肾作为例子。 FT-IR成像持有提供了一种新的途径获得的细胞和组织的生化信息完全无标记非扰动路线走向提供新的洞察生物分子的改变疾病进程的一部分,令人兴奋的应用。此外,该生物化学信息可以潜在地允许对疾病诊断的某些方面的目的和自动分析。
IR光谱已经自1930年以某种形式提供的分析工具;然而,它仅是在过去的十年中组织成像用FT-IR的面积已分解。为组织成像FT-IR的进步已经驱动了很大一部分由三个关键的发展:数据采集1)提高速度,由于大型焦平面阵列的可用性(FPA)探测器通常有数以千计的红外敏感探测器1 ,2,2)开发先进的处理算法和计算能力来处理大量高光谱数据集3和FT-IR成像系统3)造型,以最大限度地提高空间分辨率4,5。已经有不少高品质和非常广泛的文章回顾了FT-IR光谱领域最近6-16,除了自然的协议文件,详细的步骤,以取得组织17点谱或地图 。在本文中,我们将重点放在普罗特ocol得到使用在改良的FT-IR系统具有高清晰度能力的128×128焦平面探测器组织的图像。
的FT-IR成像早已被建议是一个潜在的理想的工具,细胞和组织成像,由于获得的图像,其中每一个像素具有丰富的生物化学信息的能力。的FT-IR成像是基于这样的原则,一个样本中不同的生物分子将定量吸收的中红外不同区域;这允许一个“生化指纹”的推导。该指纹已被证明在许多研究不同的细胞类型和疾病状态之间改变。不像在常规病理学的做法,即污点和免疫组化标记需要被用于可视化并确定用于指导诊断和治疗选择的细胞类型和组织的结构,从FT-IR的图像是基于组织的固有生物化学形成。目前techniq用于诊断染色组织的UE是费时的,破坏性的,费力,并且需要病理学家的主观专门知识,而FT-IR提供使这个过程的快速,非破坏性,自动化程度高,并且更加客观的潜力。此外,FT-IR提供了一种新途径,以获得额外的生物化学信息使用常规的染色技术可能不容易获得。
近年来的一个最令人振奋的进展一直是高分辨率成像方法现在,可以允许细胞类型和组织的结构,这对于全面的疾病诊断至关重要的可视化和表征的可用性。这些技术之一是衰减全反射(ATR)的FT-IR结合有高折射率其允许高分辨率成像18,具有许多非常令人兴奋的研究显示其应用19-25的固体浸没透镜(SIL)。此外,它瓦特最近证明,与ATR的成像相关联的增加的空间分辨率可允许内皮细胞和肌上皮细胞的乳腺组织中形成乳腺癌诊断26的一个关键组成部分的可视化和分类 。而ATR成像是非常有用的,这种技术要求的SIL,使与组织形成的FT-IR图像接触;因此,它的使用受到一定限制的组织病理组织所在的大区域必须快速成像。
第二种方法所表明的耦合的高倍率物镜到使用同步加速器作为红外线的一个明亮的源的现有的FT-IR系统中,也能够充分照亮FPA和图像的0.54 X 0.54微米的有效像素尺寸。这允许我们能够想象关键结构在乳腺癌和前列腺组织了未解析使用传统的FT-IR系统4。虽然这些大幅增加红外图像空间地得到解决ñ是令人兴奋的,它的使用由于需要同步仍然有限。接着,一个最佳系统的设计也可能允许高清晰度成像能力与1.1×1.1微米的像素大小而不同步加速器源的要求,而是使用传统globar IR源5。在本文中,我们显示如何修改现有的商用的FT-IR成像系统,以允许组织的衍射极限红外成像与使用多个红外目标(15X,36X,和74X)可接受的信噪比。随着三个目标的有效像素尺寸为5.5×5.5微米(15X),2.2×2.2微米(36X)和1.1×1.1微米(74X)。然后,我们给出的收益空间分辨率在肝脏和肾脏活检27病检测的重要性的一些例子。
的FT-IR是一个新兴的方式对组织切片的无标记生化显像,具有在提高诊断的病理当前标准中起重要作用的潜力。目前金标准病理组织需要被活组织检查,在福尔马林中固定,石蜡包埋,切片多次,并用多种污渍。训练有素的病理学家有主观视觉评估组织结构和细胞形态,以确定诊断。这里,我们显示了如何从相同类型的段的收集高分辨率红外图像和讨论的一些计算方法来检查的细胞类型和疾病状态之间的化学差异。
此协议中的关键步骤是,以确保组织被非常仔细地集中并且该系统是公校准,以确保非常高的质量光谱数据。设置系统时,护理尤为criti CAL和高放大倍率的目标工作时。为了帮助排除故障,下面的列表包括遇到的一些潜在的困难;
问题:在反射成像时,低IR强度。解决办法:检查IR幻灯片的方向作为反射涂层可以在幻灯片上的错误的一边。
问题:在蓝瑟控制低信号/红色预警信号。解决方案:酷探测器与LN2。液氮是必需的FPA探测器的功能,并要求定期被突破了。
问题:速度误差/移动的错误。解决方案:重新谱仪和减少振动。振动将导致在干涉仪的移动镜被干扰。
问题:数据水蒸气尖峰。解决方案:增加净化系统,保护样品空气。
问题:无效centerburst。解决方案:查找centerburst了。
e_content“>问题:在发送低通量差,即使集中解决方案:调整底部冷凝器这将发生作为红外光不被聚焦到样品上的一个点。在本文中,我们把重点放在如何获得在传输或transflectance方式组织高清晰度红外图像。的FT-IR成像的性质,是有可向数据采集多种修改,例如,类型的衬底,固定技术,样品的厚度,光谱分辨率,干涉仪反射镜的速度等这些参数的效果有最近4,5,17,51中广泛详细地进行了讨论。
有许多的修改,即,可以向包括在成像的ATR模式10,24,26和使用纳米级的热的方法52,53,以允许高分辨率红外成像的成像系统。具有高分辨率的红外成像的主要限制是,在Tissues必须小心制备和用于IR足够薄以穿过(一般为4微米厚)。此外,透射率和反射率的FT-IR成像需要试样保持干燥由于红外由水的吸光度。但是,FT-IR成像具有比其他技术显著的优点,在于它可以组织而导出丰富详尽生物化学信息非常迅速图像大的区域。该派生生物化学信息的无标记的方式中的类似技术包括拉曼光谱,但是数据采集的时间要慢得多,以获取图像。新拉曼成像方法正在出现,包括受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS);但是,他们有机会获得有限的光谱范围,或单频成像。
在数据采集,空间分辨率,和计算方法的可用性的速度的进步已经在制造的FT-IR IMAG一直是巨大的价值荷兰国际集团翻译作为病理一种新的成像工具,比较可行的办法。在空间分辨率后的最新进展已经用于组织病理学尤其重要,因为关键细胞类型不被解析的使用常规的FT-IR成像系统。在最近的一份报告雷迪等人 。说明了如何一个理想系统获得的FT-IR成像系统5的最佳空间分辨率建模。在本文提出的肾组织的示例演示,以提取从肾小球结构( 图3和图5)的生物化学信息的更高的空间分辨率的重要性。今后,在量子级联激光器非常明亮的红外光源的新进展54-57,三维光谱成像58,并在纳米技术,红外领域的突破52,53,59,60召开研究激动人心的新途径,可能有在组织成像的未来产生巨大影响。
<p cl屁股=“jove_content”>我们已经提出了在肝脏和肾脏疾病应用的例子,那里是一个需要额外的生化信息可以是诊断价值。光谱病理实验室病理学系在伊利诺伊大学芝加哥分校的重点是红外成像技术的翻译对改善疾病的诊断和改善患者预后预测。 FT-IR成像可以克服一些,其中定量和客观的信息,需要在实践中病理当前限制。尤其是,今后的工作重点是查明现有技术不能提供足够的诊断敏感性或提供的信息有限,目前病理学实践领域。显然需要存在于提高病理的现行做法,并朝着到大约患者的疾病状况的病理学家,采用高清FT-IR成像这可能是实现提供更多的信息。The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |