حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em> الليشمانيا</em> العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
intravital المجهري (IVM) هو تقنية التصوير البصرية القوية التي جعلت من الممكن التصور، ورصد وتقدير من الأحداث البيولوجية المختلفة في الوقت الحقيقي والحيوانات الحية. هذه التكنولوجيا قد تقدمت بشكل كبير من فهمنا للعمليات الفسيولوجية والظواهر بوساطة العوامل المسببة للأمراض في أجهزة معينة.
في هذه الدراسة، يتم تطبيق IVM للكبد الفأر وصممت بروتوكولات الصورة في الجسم الحي الدورة الدموية للكبد وقياس خلايا الدم الحمراء (RBC) سرعة في الأوعية الكبدية الفردية. لتصور أنواع فرعية مختلفة السفينة التي تميز الجهاز الكبدي وإجراء قياسات سرعة تدفق الدم، ويتم حقن C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد مع كاشف البلازما الفلورسنت التي تصف الأوعية الدموية المرتبطة الكبد. IVM تمكن في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وقياس سرعة RBC في وعاء محددة من الفائدة. ووضع هذه المنهجية تجعل من الممكن لالتحقيق في ديناميكا الدم في الكبد في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. في نهاية المطاف، وهذا المنهج القائم على التصوير سيكون مهما لدراسة تأثير L. عدوى اللشمانيا الحشوية على ديناميكا الدم الكبدية.
هذه الطريقة يمكن تطبيقها على نماذج المعدية الأخرى وأجهزة الماوس ويمكن أن تمتد أيضا إلى ما قبل السريرية اختبار تأثير المخدرات على الالتهاب عن طريق قياس تأثيرها على تدفق الدم.
Introduction
ديناميكا الدم الجهاز محددة هي السمات الفسيولوجية الهامة من أي جهاز الثدييات. شذوذ في تدفق الدم قد يكون نتيجة للالتهاب، وعلامة على ضعف الجهاز 1. وهكذا، وتدفق الدم التنظيم والبنية والوظيفة تظهر المعلمات الحرجة بالنسبة للتحليل في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. التقنيات التي استخدمت عادة لتحليل تدفق الدم في جهاز معين تحتوي على العديد من القيود، بما في ذلك الحد حل هذه التقنية نفسها (مثل التصوير دوبلر من تدفق الدم)، والقدرة على قياس المطلق تدفق الدم فقط (حجم الدم في وحدة خدمة جهازا) (على سبيل المثال التماسك البصري التصوير المقطعي) وقياس متوسط التغير في السرعة في عدد كبير من السكان وغير متجانسة من الأوعية الدموية 2،3. ويربط نظام الدورة الدموية والكبد فرعية سفينة المختلفة التي هي غير متجانسة في حجمها، البنية والوظيفة. فييتم تطبيق هذه الدراسة، intravital المجهري (IVM) تكنولوجيا التصوير لتقييم ديناميكا الدم الكبد في الجسم الحي، في الوقت الحقيقي، وبدقة عالية وبالتوازي للكشف عن خصائص الأوعية الدموية الفردية التي تشكل الجهاز الكبدي. التطورات الأخيرة في هذه التقنية التصوير الضوئي قوية تسمح للباحث لجمع البيانات الديناميكية على الحيوانات التي تعيش في القرار المكانية والزمانية عالية. من خلال السماح للرؤية مباشرة ومراقبة الوقت الحقيقي من العمليات البيولوجية محددة وسريعة في الجسم الحي، ويوفر IVM فرصة فريدة للباحث للسفن صورة الدم الفردية، وقياس وتحديد سرعة خلايا الدم الحمراء واحدة (RBC) ضمن مختارة خصيصا سفينة الكبدية.
في هذه الدراسة، قمنا بتنفيذ تقنية IVM في كبد الفأر لدراسة تأثير الإصابة الماوس عن طريق طفيل الليشمانيا كبدي التوجه على ديناميكا الدم في الكبد. L. اللشمانيا الحشويةهو العامل المسؤول عن داء الليشمانيات الحشوي، وهو مرض شديد يتميز الاستجابات الالتهابية الحادة على اساس المزمنة وأمراض موجودة في أجهزة متعددة، بما في ذلك الطحال والكبد. في نموذج الفأر تجريبية من داء الليشمانيات الحشوي، وإصابة الكبد في حين أن العدوى الطحال هو التدريجي 4-حل ذاتيا. هذه النتائج من العدوى الليشمانيا فيما يتعلق الأجهزة الفردية لا تزال غير مفهومة تماما. والتحقيق في الكبد والطحال ديناميكا الدم في ظل الظروف المرضية تسليط الضوء من جديد على التفاعلات المضيف الطفيلي والتسبب بالمرض.
ويستند نظامنا النموذج التجريبي على كشف وتصوير الكبد من الماوس تخدير التي تلقت حقن في الوريد من الأصباغ الفلورية محددة لوضع العلامات على intravasculature الكبدي. الكبد هو عضو مواتية للفحص المجهري داخل الحيوي. بعد إجراء incisio صغيرن في البطن، وتخريجها بلطف الكبد ويوضع على شاش مبللة، ثم على ساترة بهدف الحد من أي الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. ثم يتم وضع الكبد في ضوء عدسة المجهر. بالمقارنة مع العقدة الليمفاوية والطحال والتي تتطلب استخدام اثنين من الفوتون المجهري للدراسات IVM، والاستفادة من الكبد تكمن في هندسته المعمارية 3D متجانسة / التشريح التي تسمح لاستخدام المجهر متحد البؤر التقليدية، مع عمق الاختراق الحد الأقصى ل ما يقرب من 50 ميكرون، لحيوي داخلي المجهري التصوير 5-8.
توضح هذه الدراسة طريقتين التصوير مستقلة لقياس كمي لRBC السرعة وسرعة تدفق الدم في الأوعية الدموية الفردية. في الطريقة الأولى، يتم الحصول على تدفق الدم في الكبد باستخدام وضع ثنائية الأبعاد س ص على مر الزمن. ويتم تحليل البيانات XYT الناتجة باستخدام البرنامج المساعد MtrackJ في برنامج يماغيج مجانا، والذي يسمح لتتبع individالسياقية كرات الدم الحمراء مع مرور الوقت. في الطريقة الثانية، يتم تحديد وعاء دموي واحدة ويتم تحليل المقابلة تدفق الدم وذلك باستخدام خط المسح وضع الاستحواذ السريع للمتحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي. يتم فحص السفينة من الاهتمام في وتيرة عالية على طول المحور المركزي من خلال خط محوري. ثم يتم كميا سرعة تدفق الدم على أساس الفرق في التباين بين كريات الدم الحمراء الداكنة غير المسماة والبلازما fluorescently المسمى. يتم رسم شدة مضان من كرات الدم الحمراء والبلازما المكتسبة على طول خط المسح الضوئي مع الزمن للحصول على الشرائط، وزوايا وهي يتناسب مع سرعات لRBC الفردية.
والهدف من هذه المقالة هو توفير طريقة بسيطة وقابلة للتكرار للتصوير وقياس سرعة تدفق الدم داخل الأوعية الدموية الفردية الكبد وإتاحة الأدوات الأساسية لنجاح أداء جراحة الماوس، IVM والتحليلات الكمية للسرعة كرات الدم الحمراء الفردية. تيسوف نهجه تسمح للباحثين لاكتساب رؤى جديدة في سرعة الدم في ظل ظروف مرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التطورات الأخيرة في intravital المجهري للكبد الفأر تفتح آفاقا جديدة للتحقيق في الاستجابة الفسيولوجية للإصابة في الجسم الحي في الوقت الحقيقي 5،9،10. تدفق الدم الجهاز هو المعلمة الفسيولوجية الحرجة التي غالبا ما تتغير في كثير من الأمراض. ومع ذلك، فإن وضع ديناميكا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل INSERM، جامعة إيكس مرسيليا وجائزة التطوير المهني من HFSPO التي حصلت عليها CL فوريستير.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).
- Srinivasan, V. Absolute blood flow measured by optical methods. SPIE Newsroom. , (2011).
- Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. Measurement of liver blood flow: a review. HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).
- Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis. Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).
- Lee, W. Y., et al. An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells. Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).
- Geissmann, F., et al. Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids. PLoS Biol. 3, e113 (2005).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).
- Thiberge, S., et al. In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).
- Vacchina, P., Morales, M. A. In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).
- Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood. J. Vis. Exp. , (2012).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).
- MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy. Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).
