JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Published: February 24, 2015
doi:
10.3791/52246
, , , , , , , ,
1Department of Medicine,Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine,Weill Cornell Medical College, 3Department of Physiology and Biophysics,Weill Cornell Medical College, 4Department of Pathology,University of Michigan

Summary

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Abstract

DNA methylatie patroon mapping zwaar bestudeerd in normale en zieke weefsels. Verschillende methoden zijn vastgesteld om de cytosine methylatie patronen ondervragen cellen. Verminderde vertegenwoordiging van whole genome bisulfietsequencing is ontwikkeld om kwantitatieve basenparen resolutie cytosine methylatie patronen te detecteren bij GC-rijke genomische loci. Dit wordt bewerkstelligd door het combineren van het gebruik van een restrictie-enzym, gevolgd door bisulfiet conversie. Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing (ERRBS) verhoogt de biologisch relevante genomische loci bedekt en is gebruikt om cytosine methyleringsprofiel in DNA van mens, muis en andere organismen. ERRBS initieert met restrictie-enzym digestie van DNA laagmoleculaire fragmenten voor gebruik in de bibliotheek bereiding genereren. Deze fragmenten worden onderworpen aan standaard bibliotheek constructie voor de volgende generatie sequencing. Bisulfiet omzetting van niet-gemethyleerd cytosinen voorafgaand aan de finale amplificatiop stap kunt voor kwantitatieve basis resolutie van cytosine methylatie niveaus in overdekte genomische loci. Het protocol kan worden voltooid binnen vier dagen. Ondanks de lage complexiteit in de eerste drie bases gesequenced, ERRBS bibliotheken leveren van hoge kwaliteit van de gegevens bij het gebruik van een aangewezen sequencing controle rijstrook. Mapping en bioinformatica-analyse wordt vervolgens uitgevoerd en levert gegevens op die gemakkelijk geïntegreerd worden met verschillende genoom-brede platforms. ERRBS gebruik kunnen maken van kleine hoeveelheden grondstoffen waardoor het mogelijk is om de menselijke klinische monsters en toepasbaar te verwerken in een reeks van wetenschappelijke toepassingen. De video geproduceerd demonstreert kritische stappen van de ERRBS protocol.

Introduction

DNA methylatie op cytosine (5-methylcytosine) een epigenetische merk kritisch in zoogdiercellen voor een verscheidenheid van biologische processen, waaronder maar niet beperkt tot imprinting, X-chromosoom inactivatie, ontwikkeling en regulatie van genexpressie 1-8. De studie van DNA methylatie patronen in kwaadaardige en andere aandoeningen is bepaald ziektespecifieke patronen en bijgedragen tot het begrip van de ziekte pathogenese en potentiële biomarker ontdekkingen 9-17. Er zijn veel protocollen die de epigenome voor DNA-methylatie-status te ondervragen. Deze kunnen worden onderverdeeld in affiniteit gebaseerde, restrictie-enzym-gebaseerde en bisulfiet conversie gebaseerde testen die microarray of sequencing platforms gebruik stroomafwaarts. Verder zijn er een aantal protocollen die overbruggen deze algemene categorieën, waaronder, maar niet beperkt tot, Combinatie bisulfiet restrictieanalyse 18 en verlaagde Representation bisulfietsequencing (RRBS 19). </p>

RRBS werd oorspronkelijk beschreven door Meissner et al. 19,20. Het protocol werd een stap GC-rijke genomische regio gevolgd door bisulfiet sequencing, waardoor kwantitatieve basenpaar resolutie data kostenbesparende 21,22 verrijken. De GC-rijke gebieden doelwit van de MspI (C ^ CGG) restrictie-enzym en cytosine methylatie wordt opgelost door bisulfiet omzetting cytosinen (desaminering ongemodificeerde cytosines tot uracil), gevolgd door polymerasekettingreactie (PCR) amplificatie. RRBS onder de meeste genpromotors en CpG eilanden in een gedeelte van de sequentie die voor een genoom; echter RRBS had beperkte dekking van CpG oevers en andere intergenische regio's van biologische relevantie. Verschillende groepen hebben gepubliceerd bijgewerkt RRBS protocollen sinds het originele rapport dat verbeteren op de methodologie en de daaruit voortvloeiende dekking van deze genomische regio's 23-25. Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging Bisulfiet Sequvloeden (ERRBS) omvat bibliotheek voorbereiding wijzigingen en een alternatieve data alignment benadering 26 in vergelijking met RRBS. ERRBS resulteerde in een hoger aantal CpGs weergegeven in de verkregen gegevens en de berichtgeving van genomische regio ondervraagd 26. Deze methode werd gebruikt om DNA methylatie patronen in humane patiënt en andere dierlijke specimens 26-30 lossen.

De ERRBS beschreven protocol biedt informatie over alle stappen van voltooiing en gegevens werden gegenereerd met representatieve humaan DNA (monsters werden verkregen uit eerder gemeld, de geïdentificeerde patiëntenmonsters 31 en CD34 + beenmerg monster van een normale menselijke donor). Het protocol bevat een geautomatiseerd grootte selectieproces, waarbij de verwerkingstijd vermindert per monster en zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in de bibliotheek grootte selectie. Het protocol combineert een reeks gevestigde moleculaire biologische technieken. Hoog molecuulgewicht DNA wordt gedigereerd wet een methylatie-ongevoelige restrictie-enzym (MspI), gevolgd door end-reparatie, A-tailing, en ligatie van gemethyleerde adapters. Omvang selectie van de GC-rijke fragmenten wordt gevolgd door bisulfiet conversie en PCR-amplificatie voorafgaand aan de sequencing. Bisulfiet conversie is eerder beschreven 32 en gedetailleerd overzicht van de data-analyse en toepassingen valt buiten het bestek van dit artikel, echter aanbevelingen en referenties zijn opgenomen voor het gebruik van de lezers. Het protocol kan worden uitgevoerd in vier dagen en is vatbaar voor kleine ingang (50 ng of minder) materiaal bedragen. Het protocol beschreven levert gegevens met hoge dekking per CpG ter niet alleen voldoende voor differentiële methylering plaats en omgeving bepalingen maar ook epigenetische polymorfisme detectie zoals beschreven door Landan, et al. 33.

Protocol

Alle procedures uitgevoerd worden goedgekeurd door de Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite en volg National Institute of Health richtlijnen. 1. Chirurgische Techniek Handhaaf aseptische techniek tijdens deze procedure door steriele handschoenen, instrumenten, en een steriel chirurgisch veld volgens NIH richtlijnen 25. Steriliseren instrumenten voor het begin van de operatie door ze te autoclaveren (zie Tabel van specifieke reagentia / Apparatuur voor de volledige lijst). Gebruik een glazen kraal sterilisator om instrumenten te steriliseren tijdens de operatie. 2. Anesthesie en Voorbereiding Verdoven de muis in een narcosebox met een mengsel van 0,9 l / min zuurstof en 2,5% isofluraan met een veterinair isofluraan vaporizer systeem. Zorg ervoor dat de muis niet reageert op veranderingen in de lichaamshouding voordat u deze uit de doos. Toepassing oogzalf om de mouogen se's om hen te beschermen tegen uitdrogen. Schakel de gasstroom uit de doos om de neuskegel. Plaats de muis vierkant op zijn linkerkant op een verwarmde pad bedekt met een chirurgische pad en absorberend bankje papier met haar neus en mond in de kegel. Permanent toezicht van de muis ademhalingsritme en de snelheid en isofluraan aan te passen als dat nodig is (tussen 2,5-3% isofluraan) om een ​​adequaat niveau van anesthesie te behouden en gebruik de teen knijpen reflex om totale sedatie bevestigen. 3. Chirurgische Aanpak Lijn en de focus van de stereoscoop met het chirurgische veld. Pas de neuskegel en plak beneden zodat het gepositioneerd langs de rand van het gezichtsveld. Met de muis liggend op zijn linkerzijde, tape de rand van het rechter oor naar de neus, het blootstellen van het gebied achter het oor waar de incisie wordt gemaakt. Zorg ervoor dat de achterste auriculaire ader verplaatst zich horizontaal over het oor. Merk op dat de correcte plaatsing van tHij dier en taping van het oor zijn cruciaal om snel de gezichtszenuw. Bevochtig de vacht op en achter het oor met 70% ethanol en scheren de chirurgische site met behulp van een scheermes of een scalpel. Pre-wetting de vacht maakt het scheren makkelijker in deze anatomische locatie. Reinig de huid met een jodium oplossing, zoals Betadine chirurgische scrub (7,5% povidon-jood), gevolgd door 70% ethanol. Herhaal deze reiniging nog twee keer grondig ontsmet het gebied. Om te bepalen waar de incisie te maken, op te sporen de achterste auriculaire ader uit het oor caudaal naar het gebied posterior aan het oor uitstulping. Met behulp van de lente schaar, maak een 4 mm incisie 2-3 mm achter het uitsteeksel. Ontleden door het onderhuidse vet en fascia met behulp van stompe dissectie. Vermijd direct snijden met de schaar omdat bloedvaten of spierweefsel gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Als bloeden optreedt, druk uitoefenen op de chirurgische lokatie met een steriel wattenstaafjeten minste 30 sec. Als significant vochtverlies optreedt, injecteer de muis intraperitoneaal met maximaal 0,5 ml steriele 0,9% zoutoplossing met behulp van een 25 of 27 G naald. Gebruik een aantal belangrijke monumenten, de spinale accessoire zenuw, gehoorgang, en anterieure kauw- spieren (hieronder beschreven), naar de gezichtszenuw te lokaliseren. Ontleden rond deze monumenten tot de takken van de gezichtszenuw worden gevisualiseerd. De zenuw zal verschijnen als een belangrijke stevige witte structuur wanneer het wordt geopenbaard en een laag van fascia hecht het aan de onderliggende structuren. Vind de spinale accessoire zenuw, die reist van het caudale deel van de schedel te innerveren de trapezius spieren, zodra het onderhuidse vet en fascia zijn ontleed. De gezichtszenuw is diep om de spinale accessoire zenuw. Vind de kraakbeenvissen gehoorgang dat parelwitte eruit ziet en kan rostraal van de gezichtszenuw te zien. Vind de spierbuik van de voorste kauw- spier die ligt op de top van en caudal naar de gezichtszenuw. Wanneer de belangrijkste takken van de gezichtszenuw worden gevisualiseerd, sporen ze dorsally hun oorsprong vinden vanaf de stylomastoid foramen. Met behulp van fijne getipt Dumont tang # 5/45 aan de operatiewond open te houden, vooraf de lente schaar tips volgt het pad van de zenuw, verplaats dan de tang dorsaal naar de nieuw geavanceerde gebied open te houden. Visualiseer de stam van de gezichtszenuw met het jukbeen, buccale, en marginale mandibular takken op dit punt. OPMERKING: De tijdelijke vestiging zal dichter bij het foramen te vinden. De marginale onderkaak zenuw takken in zijn bovenste en onderste delen dichter bij de kaak, waardoor deze zenuw takken zal niet zichtbaar zijn op dit niveau zijn. Als het uitvoeren van een zenuw doorsnijding, het stabiliseren van de zenuw voorzichtig met de fijne punt tang en snijd de zenuw met de lente-schaar. Vermijd het gebruik van te veel tractie aan de zenuw met de tang om te voorkomen avulsing de zenuw van de hersenstam. Duwde stronken uit elkaar, of knippen en verwijderen van een deel van de distale zenuw om ervoor te zorgen dat er geen heraansluiting kan optreden. Als het uitvoeren van een crush, gebruiken Dumont # 5/45 tang om de zenuw te comprimeren gedurende 30 seconden met behulp van een constante druk om alle axonen verbreken, en herhaal dit oogje op een tweede hoek loodrecht op de eerste verliefdheid website. Vermijd het gebruik van variabele hoeveelheden druk tijdens de 30 sec pletten, anders zal de schade inconsistent tussen dieren zijn. 4. Sluiting and Recovery Herpositioneren het vet en spieren over de onderliggende structuren. Geschatte de randen van de incisie en de wond sluiten met een 7,5 mm wond clip. Hechtingen of lijm zijn ook aanvaardbaar voor de sluiting van de wond. Postsurgical analgetica kan worden verstrekt op dit moment. Verwijder de tape van het oor van de muis. Schakel de isofluraan stroom en laat de muis om zuivere zuurstof inademen voor 30 sec tot 1 min. Place van de muis in een lege kooi zonder strooisel om te herstellen van de anesthesie. Wanneer de muis wordt teruggewonnen, onderzoekt het gedrag voor bevestigend tekenen van gezichtsverlamming. De snorharen zal worden verlamd en schuin terug naar de wang, zal de neus worden afgeweken, en het oog zal niet knipperen in reactie op een zuchtje lucht. Huis dieren gezamenlijk na de operatie als ze vrouwelijke. Vermijd behuizing mannelijke muizen samen omdat ze meer agressief en vaak gedwongen wondklemmen hun cagemate, wat leidt tot infectie te verwijderen. Zorg postsurgical analgetica op dit moment, indien nodig. Controleer de muizen eenmaal per dag gedurende enkele dagen na de operatie te voorkomen dat infectie of andere complicatie postoperatief. Verwijder wond clips 7-10 dagen na de operatie als ze niet zijn gevallen op hun eigen. Solliciteer smeren oogzalf om het aangedane oog dagelijks naar het hoornvlies complicaties te voorkomen, hetzij tot het oog knipperreflex is rebedekt of tot euthanasie.

Representative Results

Figuur 1 geeft een overzicht van ERRBS, met de belangrijkste stappen die worden elders in de beschreven protocol. ERRBS bibliotheken werden bereid met 50 ng DNA-ingang. Evalueer de kwaliteit van de bereide bibliotheken. Productie Bibliotheek routinematig levert fractie groottes van 150-250 bp en 250-400 bp (figuur 3A-C). Kleine verschillen in de bibliotheek grootteverdelingen tussen monsters worden verwacht. Merk op dat zowel lagere als hogere bibliotheek fracties zijn zeer intens DNA formaten indicatief verrijking van een bepaalde sequentie. MspI digestie resulteert in de verrijking van een familie van herhalende DNA sequenties aanwezig in het humane genoom op 190 bp, 250 bp en 310 bp in het ERRBS bibliotheken. Deze drie herhalingen vertegenwoordigen een karakteristieke handtekening van een ERRBS bibliotheek 20 (zie figuren 3A-C en 3G). Representatieve bibliotheken werd de sequentie op een volgende generatie sequentier met behulp van single-end leest. Bij het ​​laden in de aanbevolen bibliotheek concentratie op een Illumina HiSeq 2500 sequencer, zijn cluster dichtheden van 500,000-700,000 per mm 2 verwacht. Op deze clustering dichtheid, 81,6% ± 3,14% (n = 81) van de clusters doorlaatfilter (figuur 4A). Vanwege de lage complexiteit einde van de bibliotheek inzetstukken (MspI herkenningsplaats: C ^ CGG), intensiteitswaarden en kwaliteit scores die gedurende sequencing zijn zeer variabel in de eerste drie basen (Figuur 4B-C), maar als een onafhankelijke controlelaan is opgenomen (zie bespreking), zal 85% van de bases kwaliteit scores van 30 of hoger hebben (Q30 waarden; figuur 4D). Gegevens uitlijning en cytosine methylatie als beschreven in het protocol opbrengsten basenparen resolutie (tabel 7). Voor het menselijk genoom, een 51-cyclus single-lezen sequencing aanloop van een ERRBS bibliotheek in één rijstrook van een HiSeq 2500 in high output mode regelmatigely genereert 153.194.882 ± 12.918.302 totale leest dat na de kwaliteit filtering en adapter trimmen opbrengsten 152.231.183 ± 13.189.678 leest voor input in de analyse pijplijn. Gemiddeld mapping efficiëntie voor een ERRBS bibliotheek is meestal 62,95% ± 5,92% met een vertegenwoordiging van 3.183.594 ± 713.547 CpGs met een minimale dekking per CpG van 10x en een gemiddelde dekking per CpG van 84,94 ± 16,29 (n = 100). De ERRBS protocol vatbaar is voor multiplexing (zie Aanvullende bestand 1: aanpassing Protocol voor multiplex-sequencing). Gegevens van representatieve sequencing loopt is samengevat in Figuur 5 Gegevens uit multiplex-sequencing runs (51-cycle single-lezen sequencing run;. N = 128 voor twee bibliotheken per rijstrook; n = 11 voor drie bibliotheken per rijstrook; n = 11 voor vier bibliotheken per laan) werden vergeleken met een volledige baan sequentiebepaling van een ERRBS bibliotheek (51 cycli single-lezen sequencing runs; n = 100) en downsampling één rijstrook Simulate 50%, 33% en 25% lees- per baan (2, 3, respectievelijk 4 monster multiplexen per laan; n = 3). Aangezien het aantal lees- per monster af met de multiplexfactor, het aantal CpGs bedekt minimaal bereik van 10x en de dekking per CpG daalt ook (Figuur 5 en Tabel 8). Bedoel wisselkoers van niet-CpG verwachting zijn 99,85% ± 0,04% (n = 400). Omrekeningskoersen lager dan 99% mag minder dan optimale bisulfiet conversie die kan leiden tot hoge prijzen van valse methylatie niveaus aan te geven. Gegevens uit een ERRBS bibliotheek bereid uit een vertegenwoordiger van Human genome DNA werd geanalyseerd in R 2.15.2 45 met behulp van de methylKit pakket 26 (zie Aanvullende code bestand 1 voor commando details). De gegevens kunnen worden gevisualiseerd in gangbare browsers genoom (figuur 6A). De cytosine methylering data gelijkelijk afgeleid van beide strengen (Figuur 6B) en varieert de gehelespectrum van mogelijke cytosine methylering (figuur 6C). Analyse van technische replica van een representatief menselijk DNA-monster levert hoge concordantie tussen de gegevens resultaten (figuur 6D) en omvat CpGs in een breed spectrum van genomische loci (figuur 6E en F en zoals eerder beschreven 26). Hoewel technisch replica hoge O oplevert 2 waarden (meer dan 97%), wordt de biologische replica opleveren R2 waarden variërend 0,92-0,96 26 en vergelijken van verschillende humane cel R2 lagere waarden opleveren dan 0.86 (gegevens niet getoond). Figuur 1: Stroomschema van het ERRBS protocol stappen. Grafiek geeft de stappen, die in een traditionele werk dag kan worden afgerond. * Wijst op een mogelijke pauze punt (onmiddellijk volgen ing ligatie opruimen en vóór de grootte selectie, protocol stap 5) waarmee monsters kunnen worden bij -20 alvorens tot de duur van het protocol bevroren ° C. Figuur 2: Maat selectie protocol. (A) Scherm schot van instellingen die worden gebruikt in de ERRBS Pippin Prep-protocol (zie protocol paragraaf 5.1.2 – 5.1.6): (1) Selecteer type Cassette. (2) Selecteer de standaard moet worden gebruikt. (3) Selecteer de collectie mode voor elke baan. (4) Voer de collectie bp bereiken. (5) Sla het protocol (B) Fasen van de handleiding gel extractie gebruikt in protocol paragraaf 5.2:. (1) Gevisualiseerde gel ladders. (2) Marked Maten voor maat selectie met een scheermesje. (3) Afbeelding van weggesneden monsters (lagere fractie: 150-250 bp en hogere fractie: 250-400 bp)."> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3: Kwaliteitscontrole resultaten voor representatieve ERRBS bibliotheken bereid uit menselijk DNA-monsters met behulp van een bioanalyzer machine. (A) Gel-achtige afbeelding van een standaard ladder (1), lagere bibliotheek fractie (135-240 bp fractie van Pippin Prep); 2) en de hogere bibliotheek fractie (240-410 bp fractie van Pippin Prep); . 3) (B) Bioanalyzer elektroferogram van de verwachte lagere bibliotheek fractie (C) Bioanalyzer elektroferogram van de verwachte hogere bibliotheek fractie D -.. F) Vertegenwoordiger van gegevens van een slechte kwaliteit bibliotheek prep. Gel-achtige afbeelding (D) van de standaard ladder (1), lagere bibliotheek fractie (2) en de hogere bibliotheek fractie (3). De band bij 150 bp gemarkeerd met een arrow geeft grote hoeveelheden adapter. Elektroferogram van het lager (E) en hogere bibliotheek fracties (F) met de overmaat adapter pieken bij 150 bp (aangegeven met pijlen). (G) Bioanalyzer elektroferogram van een gepoolde ERRBS bibliotheek voor sequencing. Rode trace staat voor een hoge kwaliteit gepoolde bibliotheek met een gelijke vertegenwoordiging van hogere en lagere fracties. Blauw spoor vertegenwoordigt een samengevoegde bibliotheek niet voldoende voor sequencing te wijten aan een gebrek aan gelijke vertegenwoordiging van de hogere en lagere fracties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 4: Sequencing grafieken voor een representatieve ERRBS 51-cycle single-lezen sequencing run op een HiSeq 2500 sequencer in hoge outputmodus. (A) Cluster dichtheden (K / mm 2 = 1000 clusters per millimeter kwadraat; blauw). En cluster dichtheden passeren filter (groen) in twee rijstroken met ERRBS bibliotheken (B) Typische intensiteiten gezien in de eerste 30 cycli in een laan met een ERRBS bibliotheek. Let op de CGG handtekening van MspI spijsvertering in de intensiteiten van de eerste drie cycli. (C) Percentage van bases met een kwaliteit score van 30 of hoger (%> Q30) voor elke cyclus in één ERRBS rijstrook. (D) Kwaliteit score distributie voor alle cycli in een ERRBS rijstrook. Blauw = minder dan Q30, groen = groter dan of gelijk aan Q30. In deze laan, 84,7% van de bases had kwaliteit scores van 30 of hoger. Figuur 5: Sequencing uitgang resultaten. Box plots van experimentele gegevens uit multiplex en enkel monster per rijstrook sequencing ru ns (weergegeven als groene vakjes) en van gegevens afkomstig van gesimuleerde downsampling uit sequencing runs van drie ERRBS bibliotheken (weergegeven als blauwe dozen; bemonsterd vijf keer voor elke sequencing run) van 51-cyclus single-lezen sequencing loopt De multiplexing factor komt overeen met. het aantal ERRBS bibliotheken gesequenced per rijstrook. 1 = geheel rijstrook of 100% van leest en vertegenwoordigt de gegevens van een enkele ERRBS bibliotheek per rijstrook; 2 = 50% van de rijstrook en vertegenwoordigt gegevens van twee ERRBS bibliotheken per rijstrook; 3 = 33% van een rijstrook en vertegenwoordigt gegevens van drie ERRBS bibliotheken per rijstrook; en, 4 = 25% van een rijstrook en vertegenwoordigt de gegevens van vier ERRBS bibliotheken per rijstrook. (A) De lees telt, of het aantal sequenties geanalyseerd, per multiplexing factor. (B) Het aantal CpG's gedekt door de sequencing data per multiplexing factor. (C) De gemiddelde dekking per CpG per multiplexfactor._blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: Vertegenwoordiger van gegevens uit een ERRBS bibliotheek bereid uit menselijk genoom DNA (A), University of California, Santa Cruz (UCSC) genoom browser 43 beeld van representatieve gegevens van een ERRBS sequencing rijstrook.. De y-as vertegenwoordigt schaalbalk 0-100% methylatie bij elke cytosine bedekt met een minimum van 10x. De top aangepaste spoor vertegenwoordigt de voorwaartse streng en de lagere aangepaste spoor vertegenwoordigt het omgekeerde streng. Getoond is chr12:.. 6,489,523-6,802,422 (hg19) inclusief RefSeq genen en CpG eilanden binnen deze genomische regio (B) Distributie histogrammen van CpG dekking langs vooruit en achteruit strengen in een vertegenwoordiger van Human CD34 + beenmerg monster (C) Distributie histogramvan CpG methylatie niveaus langs beide strengen in een vertegenwoordiger van Human CD34 + beenmergmonster. (D) Correlatie perceel van CpG methylatie niveaus, van een vertegenwoordiger technische replica van een menselijk DNA-monster. (E) Pie grafiek illustreert de proporties van CpGs bedekt met ERRBS waarin geannoteerde om CpG eilanden (lichtgroen), CpG oevers (grijs) en andere regio's (wit) in een representatieve steekproef op basis van menselijk genoom DNA. (F) cirkeldiagram illustreert de proporties van CpGs bedekt met ERRBS die geannoteerde naar genpromoters (rood ), exons (groen), introns (blauw) en intergenische regio's (paars). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Reagens Volume Commentaar <td> 10x T4 DNA Ligase Reaction Buffer 10 gl Deoxynucleotidetrifosfaat (dNTP) Solution Mix 4 ui mix van 10 mM van elk nucleotide T4 DNA Polymerase 5 gl 3000 eenheden / ml DNA polymerase I Groot (Klenow) Fragment 1 pi 5000 eenheden / ml T4 Polynucleotide Kinase 5 gl 10.000 eenheden / ml DNase-vrij water 45 pi Tabel 1:. Einde reparatie reactiereagentia reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de eind reparatie reactie (protocol stap 2.1). Reagens Volume Commentaar 10x reactie buffer 5 gl bijvoorbeeld, NEBuffer 2 1 mM 2'-deoxyadenosine 5'-trifosfaat (dATP) 10 gl Klenow Fragment (3 '→ 5' exo-) 3 ui 5000 eenheden / ml Tabel 2:. A-tailing reactie reagentia reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de A-tailing reactie (protocol stap 3.1). Reagens Volume Commentaar 15 uM gegloeid adapters in DNase-vrij water 3 ui PE adapter 1,0 en PE adapter 2,0; zie tabel 4 voor sequenties en referentie 10x T4 DNA Ligase Reaction Buffer 581; l T4 DNA Ligase 1 pi 2.000.000 eenheden / ml DNase-vrij water 31 pi Tabel 3: Adapter ligeringsreactie reagentia reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de adapter ligatiereactie (protocol stap 4.2).. Tabel 4:. Oligo in de ERRBS protocol Lijst van oligo's gebruikt in de ERRBS protocol in de ligatiereactie (protocol stap 4) en PCR amplificatie stappen (protocol stap 7). Reagens Volume Commentaar 10x FastStart High Fidelity Reaction Buffer with 18 mM magnesiumchloride 20 gl 10 mM dNTP Mix Solution 5 gl 25 uM PCR-primer PE 1,0 4 ui Zie tabel 4 25 uM PCR-primer PE 2,0 4 ui Zie tabel 4 FastStart High Fidelity Enzyme 2 pi 5 eenheden / ul FastStart Taq DNA polymerase DNase-vrij water 125 ul Tabel 5: PCR-reactiereagentia reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de PCR amplificatie reactie (protocol stap 7.1).. Protocol stap Reagens / protocol detail </strong> Input hoeveelheid DNA 5-10 ng 25 ng 50 ng 1 MspI enzym 1 pi 2 pi 2 pi MspI digest reactie volume 50 100 100 4 Adapters in ligatiereactie 1 pi 2 pi 3 ui Ligatie reactievolume 20 gl 25 gl 50 gl 5 Grootte selectie protocol Alleen handmatig gel Pippin Prep of handmatige gel Pippin Prep of handmatige gel 7 PCR primer concentratie 25 uM 25 uM 10 uM gedurende 14 cycli; 25 uM gedurende 18 cycli </tr> Aantal PCR-cycli 18 18 14-18 Tabel 6:. Protocol stap modificaties voor hoeveelheden grondstoffen variërend 5-50 ng Verschillende stappen in het hele protocol vereist wijziging van reagens hoeveelheden gebruikt om de kwaliteit van de bibliotheken van verschillende hoeveelheden van de grondstoffen hoog te genereren. Wijzigingen in de belangrijkste reagens hoeveelheden zijn hier opgenomen. Pas buffer en water volumes in reacties dienovereenkomstig. Chr Base Streng Dekking freqC freqT Chr1 10564 R 366 85.52 14.48 Chr1 10571 F 423 91,25 8.75 Chr1 10542 F 432 91.2 8.8 Chr1 10563 F 429 94,64 5.36 Chr1 10572 R 366 96.99 3.01 Chr1 10590 R 370 88.11 11.89 Chr1 10526 R 350 92 8 Chr1 10543 R 368 92,93 7.07 Chr1 10525 F 433 91,92 8.08 Chr1 10497 F 435 88,74 11.26 <p class = "jove_content"> Tabel 7: Vertegenwoordiger ERRBS gegevens. Nadat de gegevens uitlijning en cytosine methylatie vastberadenheid, basenparen data wordt verkregen voor elk CpG gedekt, zal de uitlijning protocol zoals beschreven de genomische coördinaat (kolommen: chr = chromosoom, Base en Strand) te bepalen., De dekkingsgraad van de specifieke locus (Coverage ), en de snelheid van detectie cytosine versus thymidine als percentage (freqC en freqT respectievelijk). Aantal ERRBS bibliotheken per rijstrook Gemiddeld aantal unieke uitgelijnd leest Gemiddeld aantal CpGs gedekt Bedoel dekking per CpG 1 152.231.184 ± 13.189.678 3.183.594 ± 713.547 85 ± 16 2 77.680.837 ± 7.657.058 2.674.823± 153.494 49 ± 9 3 49.938.156 ± 2.436.865 2.552.186 ± – 76.624 39 ± 2 4 34.457.208 ± 4.441.686 1.814.461 ± 144.339 28 ± 4 Tabel 8:. Vertegenwoordiger van de parameters van het sequencen van enkele en multiplex ERRBS bibliotheken Getoond wordt de data per rijstrook van 51-cyclus single-lezen sequencing runs: gemiddelde en de standaardafwijking van een unieke lijn leest, aantal CpGs gedekt en dekking per CpG website verkregen van sequencing van enkele ERRBS bibliotheken per rijstrook (n = 100), twee ERRBS bibliotheken per rijstrook (n = 128), drie ERRBS bibliotheken per rijstrook (n = 11), en vier ERRBS libraries per rijstrook (n = 11).

Discussion

Het protocol gepresenteerde rendementen basepaarvolgorde resolutie data van cytosine methylatie bij biologisch relevante genomische regio. Het protocol zoals geschreven is geoptimaliseerd voor 50 ng uitgangsmateriaal, maar het kan worden aangepast aan verschillende uitgangsmateriaal (5 ng of meer) 26 verwerken. Dit aanpassing van enkele protocol stappen vereisen zoals in Tabel 6. De ERRBS bibliotheken vatbaar voor gepaarde einde sequentiebepaling en verdere genomische dekking kan ook worden bereikt door sequentiebepaling langer dan 51 cycli leest. Multiplexed sequenering lagere kosten per monster protocol bieden, maar dit leidt tot verminderde dekking per CpG plaats weergegeven in de data (Figuur 5 en Tabel 8), en voldoende diepte dekking analyses die een hoge dekking per vereisen voeren niet opleveren CpG website (bv zoals beschreven door Landan et al. 33). Tot slot wordt in dit protocol (of een bisulfiet gebaseerd protocol) kan niet tussen methyl-cytosine en hydroxymethyl-cytosine 46,47. De stroom kunnen worden geïntegreerd met andere protocolgegevens resultaten 48,49 de verschillende wijzigingen bakenen, en andere modificaties cytosine onlangs gemeld 50, moeten ze van belang.

Hoogwaardige bibliotheken verschijnen zoals getoond in figuur 3A-C, en eenmaal samengevoegd voor sequencing levert een spoor zoals in figuur 3G (rood trace) die gelijke molaire bijdragen van beide bibliotheek fracties. Bibliotheek bereiding storing tot vanaf elke stap in de procedure. Als afgebroken DNA verwerkt zal resulteren in bibliotheken die niet verrijkt zijn MspI fragmenten en derhalve in lage CpG dekking met de sequentie parameters in dit protocol beschreven. Als een enzym niet-functionele of onbedoeld buiten één van de reacties, zal het protocol niet de verwachte bibliotheek opleveren. Indien de ligatie reactie is inefficiënt, adapters zijn bij een hogere concentratie dan verwacht, en / of de primers gebruikte concentratie een beperkende reagens voor de uiteindelijke amplificatie stappen kan bibliotheek storing optreden. Overmaat adapters (gezien als pieken bij -150 bp bioanalyzer resultaten Figuur 3D-F) in de bibliotheek ook interfereren met sequencing vanwege de willekeurige clustering van zowel de bibliotheek en overmaat adapters. Hoewel een dergelijke bibliotheek kan blijkbaar normaal sequentie, een aanzienlijk deel van de leest wordt alleen adaptersequenties. Als er teveel adapters worden waargenomen in een bibliotheek, is het het beste om de bibliotheek voorbereiding herhalen als materiaal beschikbaar is met behulp van een optimale inbreng materiaal om kwantiteit verhoudingen adapter. Tenslotte efficiënte PCR amplificatie van de bibliotheken te waarborgen, worden de lagere en hogere bibliotheek fracties gehandhaafd als afzonderlijke monsters gehele bisulfiet conversie en PCR verrijking stappen. Gebeurt dit niet, levert differentiële efficiëntie van de amplificatie tijdens de PCR reactie van hogere en lagere fracties (zoals getoond in figuur 3G blauw spoor) en de mogelijke ongelijke vertegenwoordiging van de respectievelijke genomische loci die in elke bibliotheek fractie tijdens sequencing. De gebruiker kan ervoor kiezen om een ​​kwantitatieve PCR stap onmiddellijk na bisulfiet conversie voor verdere titratie optimale PCR-cycli nodig voor het amplificeren bibliotheken gegenereerd omvatten.

ERRBS voorbereiding bibliotheek protocol heeft een aantal belangrijke stappen in die specifieke reagentia worden aanbevolen. Eind-repair stap het gebruik van een vier-nucleotide dNTP mix maakt einde reparatie van producten de CG overhang, zoals die welke voortvloeien uit MspI ster enzymatische activiteit en geknipt DNA fragmenten aanwezig in de oorspronkelijke DNA-monster bevat. Dit resulteert in een verbeterde CpG vertegenwoordiging in de resultaten. Op ligatie stap is het essentieel om een ​​hoge concentratie ligase (2.000.000 eenheden / ml) en gemethyleerde adapters zodat de ligatie reaction is efficiënt en de bisulfiet omzetting niet de adaptersequenties essentieel voor nauwkeurige gegevens uitlijning beïnvloeden. Bij de PCR stap met een polymerase kan amplificeren bisulfiet behandelde GC-rijke DNA-fragmenten dient voor hoge specificiteit. Tot slot, om de eliminatie van overtollige adapters en primers zorgen, SPRI kraal zuivering (bijvoorbeeld: Agencourt AMPure XP) wordt eerder aanbevolen dan kolom gebaseerde testen voor ligatie en PCR-product isolaties.

Om een ​​hoge kwaliteit te genereren, is het belangrijk om doelmatige bisulfiet conversie waarborgen. De gepresenteerde controle biedt de gebruiker de mogelijkheid om omzettingsrendement voor sequencing bepalen. Als alternatief kan een niet-humaan DNA zoals lambda DNA worden gebruikt als een interne controle (piek-in). Door de verschillen in soort, kan dit type controle direct in stroomafwaartse sequentie (bijvoorbeeld zoals gebruikt door Yu et al. 34). Indien de piek in is gebruikt, kan het niet worden gebruikt om omzettingsrendement voor bibliotheek sequencing bepalen tenzij uniek geamplificeerd en onafhankelijk sequentie voor bibliotheek sequencing. De omrekeningskoersen die zijn gebaseerd op de methylering status van niet-CpG sites. Dit kan niet geschikt voor gebruik in de context van hoge cytosine methylatie in niet-CpG context (bijvoorbeeld embryonale stamcellen) en parallel monsters of andere middelen voor de beoordeling van omzettingsrendement kan worden gebruikt voor dit doel.

Er zijn enkele restricties aan te pakken die uniek zijn voor de sequencing van ERRBS bibliotheken. De eerste drie basen van de bibliotheek fracties sequentie bijna uniform niet willekeurig door de MspI erkenning snede ter (C ^ CGG, zie figuur 4B, C). Dit resulteert in de mogelijkheid van een aanzienlijk verlies van gegevens als gevolg van lage kwaliteit leest als gevolg van slechte cluster lokalisatie ondanks kennelijk grote cluster dichtheid tijdens sequencing. Om deze barrière te overwinnen,onder andere een hoge complexiteit bibliotheek in een onafhankelijke rijstrook (PhiX controle of een ander type bibliotheek) als een speciale controle rijstrook. Hoge complexiteit bibliotheken hebben einden die een evenwichtige vertegenwoordiging van A, C, T en G in de eerste vier basen sequentie. Geschikte rijstroken omvatten bibliotheken, zoals RNA-seq, ChIP-seq, whole genome sequencing, of een controle door de fabrikant aangeboden sequencing machine (bijv PhiX Controle v3). Wanneer aangewezen als controle rijstrook voor de respectieve sequencing run, kan het dienen als basis voor de matrix generatie die wordt gebruikt tijdens de eerste vier basen van sequencing tot cluster posities op te sporen. De hogere kwaliteit leest gevangen zal het gemiddelde dekking per CpG ter verhogen met 5,2 (n = 4). Als alternatief kan dit technische probleem ook worden opgelost met behulp van een donkere sequencing aanpak zoals eerder beschreven 23. Andere sequencing criteria volgen standard operating procedures per protocollen van de fabrikant. Ten slotte is de dekking per CpG cHosen voor data-analyse zal worden geleid door de gebruiker en voor een deel door de biologische vragen van belang. 10x dekking drempel biedt een hoge dekking analyse aanpak, maar deze drempel kan worden verlaagd zou dat van belang zijn.

Een volledige bespreking van ERRBS data-analyse valt buiten het bestek van dit artikel, echter differentieel gemethyleerde cytosines en regio's kan worden bepaald met behulp van open source tools 31,51-53. Aanvullende overwegingen en benaderingen analyse zijn goed beschreven 54,55, en de lezer wordt aangemoedigd om de literatuur te zoeken naar instrumenten het meest geschikt om de geplande analyse.

In vergelijking met andere gepubliceerde methoden, ERRBS biedt een vierdaagse protocol dat wanneer deze wordt uitgevoerd zoals beschreven opbrengsten hoge tarieven van de reproduceerbaarheid. Er is gevalideerd vergeleken met de gouden standaard MassARRAY EpiTYPER 26, rendabel voor hoge dekkingsgegevens, en is aanpasbaar voor diverse uitgangsmateriaalhoeveelheden (gunstig voor klinische monster verwerking en andere celtypen van lage frequentie) en sequencing benaderingen. Het biedt basenparen resolutie van biologisch relevante loci en kan in integratieve analyses met andere technieken profilering genoombrede transcriptiefactor bindende, chromatine hermodellering, epigenetische merken en andere cytosine modificaties van belang. ERRBS gegevens gebruik in dergelijke studies kunnen bijdragen tot een omvattende moleculaire benadering en maken hoogdimensionale analyses in de studie van biologische modellen en menselijke ziekten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description URL
MspI New England Biolabs R0106M 100,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0106-mspi
NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2 https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2
Phenol solution Sigma-Aldrich P4557 Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432
Glycogen Sigma-Aldrich G1767 19-22 mg/ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767
NaOAc Sigma-Aldrich S7899 3M pH 5.2 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503 prepare a 1M pH 8.5 solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) Sigma-Aldrich T9285 Dilute to 1X buffer solution per manufacturer's recommendations http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202S 10X concentration https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L 10 mM each nucleotide https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L 3,000 units/ml https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210L 5,000 units/ml https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Used for DNA product purification in protocol step 2.3 http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) Promega U1201 100 mM http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs M0212L 5,000 units/ml https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Used for DNA product purification in protocol step 3.3 http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202M 2,000,000 units/ml https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase
Methylation Adapter Oligo Kit Illumina ME-100-0010
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free Sage Science CDF2010 with internal standards http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f
Certified Low Range Ultra Agarose Bio-Rad 161-3106 http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich T4415 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510
50 bp DNA Ladder NEB N3236S https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder
100 bp DNA Ladder NEB N3231S https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder
Gel Loading Dye, Orange (6X) NEB B7022S https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x
Scalpel Blade No. 11 Fisher Scientific 3120030 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&tab=Items&productId=11876776
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001 Used in protocol step 6.2 http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo Research D5030 Alternative for step 6.2 http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit
Universal Methylated Human DNA Standard Zymo Research D5011 Used as bisulfite conversion control http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard
FastStart High Fidelity PCR System Roche 03553426001 http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854 A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&tabId=AG-PR-1069
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&tabId=AG-PR-1001
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn
HiSeq 2500 Illumina http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn
Pippin Prep Sage Science http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS Illumina GD-401-3001 http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn
TruSeq SBS Kit v3-HS Illumina FC-401-3002 http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn
TruSeq RNA Sample prep Illumina RS-122-2001 Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn
Microcentrifuge
Vortex Mixer
Dry Block Heater
Thermal Cycler
Water Bath
Gel electrophoresis system
Electrophoresis power supply
Gel doc
UV or blue light transilluminator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, P. A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat Rev Genet. 13 (7), 484-492 (2012).
  2. Barlow, D. P. Genomic imprinting: a mammalian epigenetic discovery model. Annual Review Of Genetics. 45, 379-403 (2011).
  3. Thiagarajan, R. D., Morey, R., Laurent, L. C. The epigenome in pluripotency and differentiation. Epigenomics. 6 (1), 121-137 (2014).
  4. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447 (7143), 425-432 (2007).
  5. Hartnett, L., Egan, L. J. Inflammation, DNA methylation and colitis-associated cancer. Carcinogenesis. 33 (4), 723-731 (2012).
  6. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet. 14 (3), 204-220 (2013).
  7. Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69 (6), 915-926 (1992).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99 (3), 247-257 (1999).
  9. Feinberg, A. P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature. 447 (7143), 433-440 (2007).
  10. Bock, C. Epigenetic biomarker development. Epigenomics. 1 (1), 99-110 (2009).
  11. Laird, P. W. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer. 3 (4), 253-266 (2003).
  12. How Kit, A., Nielsen, H. M., Tost, J. DNA methylation based biomarkers: practical considerations and applications. Biochimie. 94 (11), 2314-2337 (2012).
  13. Mikeska, T., Bock, C., Do, H., Dobrovic, A. DNA methylation biomarkers in cancer: progress towards clinical implementation. Expert Review Of Molecular Diagnostics. 12 (5), 473-487 (2012).
  14. Gyparaki, M. T., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. Journal of Molecular Medicine. 91 (11), 1249-1256 (2013).
  15. Figueroa, M. E., et al. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 17 (1), 13-27 (2010).
  16. Heyn, H., Mendez-Gonzalez, J., Esteller, M. Epigenetic profiling joins personalized cancer medicine. Expert review of Molecular Diagnostics. 13 (5), 473-479 (2013).
  17. Kulis, M., Esteller, M. DNA methylation and cancer. Advances in Genetics. 70, 27-56 (2010).
  18. Xiong, Z., Laird, P. W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25 (12), 2532-2534 (1997).
  19. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  20. Gu, H., et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling. Nat Protoc. 6 (4), 468-481 (2011).
  21. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nat Biotechnol. 28 (10), 1106-1114 (2010).
  22. Harris, R. A., et al. Comparison of sequencing-based methods to profile DNA methylation and identification of monoallelic epigenetic modifications. Nat Biotechnol. 28 (10), 1097-1105 (2010).
  23. Boyle, P., et al. Gel-free multiplexed reduced representation bisulfite sequencing for large-scale DNA methylation profiling. Genome Biol. 13 (10), R92 (2012).
  24. Chatterjee, A., Rodger, E. J., Stockwell, P. A., Weeks, R. J., Morison, I. M. Technical considerations for reduced representation bisulfite sequencing with multiplexed libraries. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 741542 (2012).
  25. Lee, Y. K., et al. Improved reduced representation bisulfite sequencing for epigenomic profiling of clinical samples. Biological Procedures Online. 16 (1), 1 (2014).
  26. Akalin, A., et al. Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia. PLoS Genet. 8 (6), e1002781 (2012).
  27. Hatzi, K., et al. A Hybrid Mechanism of Action for BCL6 in B Cells Defined by Formation of Functionally Distinct Complexes at Enhancers and Promoters. Cell Reports. 4 (3), 578-588 (2013).
  28. Will, B., et al. Satb1 regulates the self-renewal of hematopoietic stem cells by promoting quiescence and repressing differentiation commitment. Nature Immunology. 14 (5), 437-445 (2013).
  29. Lu, C., et al. Induction of sarcomas by mutant IDH2. Genes Dev. 27 (18), 1986-1998 (2013).
  30. Kumar, R., et al. AID stabilizes stem-cell phenotype by removing epigenetic memory of pluripotency genes. Nature. 500 (7460), 89-92 (2013).
  31. Li, S., et al. An optimized algorithm for detecting and annotating regional differential methylation. BMC Bioinformatics. 14, S10 (2013).
  32. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Journal of Visualized Experiments. (56), 3170 (2011).
  33. Landan, G., et al. Epigenetic polymorphism and the stochastic formation of differentially methylated regions in normal and cancerous tissues. Nat Genet. 44 (11), 1207-1214 (2012).
  34. Yu, M., et al. Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (12), 2159-2170 (2012).
  35. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  36. Dorff, K. C., et al. GobyWeb: simplified management and analysis of gene expression and DNA methylation sequencing data. PLoS One. 8 (7), e69666 (2013).
  37. Roehr, J. T., Dodt, M., Ahmed, R., Dieterich, C. Flexbar − flexible barcode and adapter processing for next-generation sequencing platforms. MDPI Biology. 1 (3), 895-905 (2012).
  38. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, North America. 17 (1), 10-12 (2011).
  39. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  40. Needleman, S. B., Wunsch, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48 (3), 443-453 (1970).
  41. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  42. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  44. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  45. Team, R. C. R. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, (2012).
  46. Nestor, C., Ruzov, A., Meehan, R., Dunican, D. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. BioTechniques. 48 (4), 317-319 (2010).
  47. Huang, Y., et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5 (1), e8888 (2010).
  48. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  49. Song, C. X., et al. Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell. 153 (3), 678-691 (2013).
  50. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
  51. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biol. 13 (10), R87-1186 (2012).
  52. Stockwell, P. A., Chatterjee, A., Rodger, E. J., Morison, I. M. DMAP: Differential Methylation Analysis Package for RRBS and WGBS data. Bioinformatics. 30 (13), 1814-1822 (2014).
  53. Sun, D., et al. MOABS: model based analysis of bisulfite sequencing data. Genome Biol. 15 (2), R38 (2014).
  54. Bock, C. Analysing and interpreting DNA methylation data. Nat Rev Genet. 13 (10), 705-719 (2012).
  55. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).

Tags

DNA MethylationBisulfite SequencingReduced RepresentationERRBSBase Pair ResolutionQuantitative MethylationGenomic LociRestriction EnzymeNext-generation SequencingBioinformatics Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan, C. K., Kacmarczyk, T. J., Ishii, J., Betel, D., Alonso, A., Mason, C. E., Figueroa, M. E., Melnick, A. M. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution. J. Vis. Exp. (96), e52246, doi:10.3791/52246 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image