We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.
Nós apresentamos um protocolo para a medição da rigidez aórtica vivo em ratos usando ultra-sonografia de alta resolução. Diâmetro aórtico é medido por ultra-sons e a pressão sanguínea aórtica é medido de forma invasiva com um cateter de pressão de estado sólido. A pressão arterial é levantada depois baixou de forma incremental por infusão intravenosa de drogas vasoativas fenilefrina e nitroprussiato de sódio. Diâmetro aórtico é medido para cada etapa de pressão para caracterizar as relações de pressão de diâmetro da aorta ascendente. Rigidez índices derivados da relação de pressão de diâmetro pode ser calculado a partir dos dados recolhidos. Cálculo da complacência arterial é descrito neste protocolo.
Esta técnica pode ser utilizada para estudar os mecanismos subjacentes a rigidez da aorta aumentado associado com doença cardiovascular e envelhecimento. A técnica produz uma medida fisiologicamente relevante de rigidez em relação ao ex vivo aproxima porque phinfluências ysiological na rigidez aórtica são incorporados na medição. A principal limitação desta técnica é o erro de medição introduzido a partir do movimento da aorta durante o ciclo cardíaco. Este movimento pode ser compensada através do ajuste da localização da sonda com o movimento da aorta, bem como fazer múltiplas medições de pressão a relação de diâmetro da aorta e expandir o tamanho grupo experimental.
O aumento da rigidez aórtica é uma característica da doença cardiovascular. Envelhecimento 1, fumar 2, 3 diabetes, hiperlipidemia 4, e outros factores de risco de doença cardiovascular têm sido mostrados para aumentar a rigidez da aorta. Estudos epidemiológicos têm demonstrado mais rigidez aórtica como um poderoso preditor independente de o aparecimento da doença cardíaca coronariana e acidente vascular cerebral, bem como a ocorrência de eventos e mortalidade 5-8 cardiovasculares. Devido à importância clínica e de saúde pública da rigidez aórtica aumentada, a pesquisa atual está focada na compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão da rigidez vascular. Portanto, grande interesse existe no desenvolvimento de medidas precisas de rigidez vascular em modelos experimentais de doença cardiovascular.
A rigidez do material pode ser caracterizado pela sua relação de tensão-deformação e quantificados como modificação elásticaulus. Um material elástico linear deforma reversível e seu estresse aumenta proporcionalmente à tensão. A aorta e as artérias são grandes corpos elásticos não lineares: quando esticado, a rigidez da artéria não permanece constante, mas aumenta com o grau de distensão. Esta não-linearidade das propriedades mecânicas de grandes artérias é devido às diferentes propriedades de rigidez dos elementos de suporte de cargas, ou seja, a elastina e o colagénio, o que constitui a parede do vaso. A elastina é altamente extensível, com um módulo de elasticidade de 0,6 MPa. Em comparação, o colagénio é muito rígido com um módulo de elasticidade de 1 GPa 9. A rigidez inicial exibido pela aorta em valores de deformação mais baixos é atribuída a elastina, enquanto a alta rigidez exposto em valores elevados de tensão é devido ao colágeno. A carga é transferida da elastina como o colagénio para o navio e distende-se esta região de transferência de carga é o sistema vascular, onde opera. Portanto, a pressões fisiológicas, a rigidez arterialdepende da contribuição de ambos elastina e colágeno 10.
A distribuição e orientação de colagénio e elastina variar por camada dentro da parede arterial. Nos meios de comunicação, a elastina, colágeno e células musculares lisas são empacotados em hélices apertados que estão em camadas de forma concêntrica. Este arranjo permite que a artéria para resistir cargas elevadas na direcção circunferencial. A adventícia é predominantemente colágeno com pouca elastina e fibras de colágeno são organizados de forma net-like. Estas fibras de colágeno são ondulado em um estado átono e endireitar como carga aumenta. Aumenta rigidez, as fibras de colágeno endireitar, impedindo assim a artéria de overstretching e ruptura. Por causa da organização estrutural e orientação variável das fibras de colágeno, as artérias são anisotrópica: a rigidez exibiu depende se o navio é esticada longitudinalmente ou circunferencial 11 in vivo stiffnes.s é, portanto, um composto de rigidez longitudinal e circunferencial da aorta.
A rigidez arterial é geralmente quantificada in vivo como velocidade de onda de cumprimento ou de pulso (VOP). Complacência arterial é definido como C = ΔD / AP onde ΔD é a mudança de diâmetro e AP é a mudança correspondente na pressão. Os valores mais baixos de cumprimento indicam vasos mais duras. A conformidade é calculado a partir da relação de pressão de dimensão da artéria e é, portanto, uma medida directa de rigidez. Como rigidez é disseminada não uniformemente na vasculatura 12, cumprimento deverá ser medido no mesmo local / semelhantes em cada disciplina para fazer comparações significativas entre os grupos experimentais.
A diferença entre a aderência e o módulo de elasticidade é que o módulo de elasticidade é normalizado com as dimensões do material. Conformidade reflecte, portanto, a rigidez estrutural, ao passo que o módulo elástico reflects rigidez do material. Com o envelhecimento, parede arterial espessura aumenta e elastina / proporção de colágeno diminui, por isso tanto a rigidez estrutural e rigidez do material são maiores.
Em comparação com o cumprimento, a VOP é uma medida indireta da rigidez arterial. VOP é a velocidade a que um impulso de pressão desloca ao longo de um comprimento da artéria e é influenciada pelas propriedades da parede do vaso. A equação Moens-Korteweg é utilizado para modelar a relação entre VOP e módulo de elasticidade: VOP 2 = E h / (2 ρ r) onde E é o módulo elástico incremental, h é a espessura da parede, ρ é a viscosidade do sangue, e r é raio do vaso . Por conseguinte, um valor mais elevado VOP sugere um navio mais rígida.
Compliance e módulo de elasticidade pode ser medido experimentalmente ex vivo em um segmento extirpado da embarcação. Para determinar a conformidade, o segmento do vaso é montado sobre uma pressão myograph 13,14. Pressão dentro do vaso é aumentado passo a passo e the resultando mudança de diâmetro é rastreado usando microscopia de vídeo. Compliance é determinada a partir dos dados de pressão de diâmetro. Módulo de elasticidade incremental pode ser medido por ensaio de tracção. Nestas experiências, o recipiente é puxado para além dos dados escalonada e força-deslocamento é recolhido até que o anel vaso quebras. Os valores de tensão e deformação podem ser calculados e plotados para determinar o módulo de elasticidade incremental. Estes ex vivo abordagens podem ser usadas para avaliar as alterações nas propriedades passivas que influenciam a rigidez.
In vivo, para além da parede de conteúdo, rigidez vascular é influenciada de forma dinâmica pelo tono do músculo liso e 13,15,16 pressão arterial. VOP é o método mais utilizado para a medição da rigidez aórtica vivo em modelos experimentais. VOP pode ser determinada de forma não invasiva com ultra-som Doppler ou tonometria de aplanação 17. Pulso de pressão é medido em dois pontos separados e o tempo necessário parao pulso para atravessar a distância é a velocidade da onda de pulso. Porque VOP é medida ao longo de um comprimento da aorta, que é um valor médio da rigidez. As grandes artérias são não-linear elástico, de modo a rigidez e, portanto, a VOP irá variar com a pressão arterial. Um valor maior VOP poderia, portanto, surgir do aumento da rigidez ou pressão elevada. Valores da VOP, portanto, deve ser normalizado a pressão arterial para tirar conclusões sobre a rigidez da embarcação. Os métodos de medição que incorporam a influência da pressão arterial com as propriedades passivas da parede vascular e os efeitos de mediadores vasoactivos que alteram o tom produziria um índice fisiologicamente relevante de rigidez arterial. Esta abordagem é implementada pela medição VOP invasiva com um cateter com dois sensores de pressão separados a uma distância fixa 13. Este cateter de pressão dupla é inserido na aorta e as drogas vasoactivas, tais como a fenilefrina ou nitroprussiato de sódio, são infundidos intravenosamente atravésum cateter venoso para levantar e pressão arterial mais baixa.
Este protocolo descreve um método para determinar a rigidez da aorta in vivo a partir da sua relação de pressão de dimensão num modelo de ratinho. Esta abordagem oferece várias vantagens sobre a medição invasiva VOP. Índices de rigidez, tal como o cumprimento, pode ser calculada a partir dos dados de pressão de dimensão recolhidos por este procedimento. Além disso, esta técnica permite a medição da rigidez aórtica local, pois a rigidez é medido a partir de um único local. Esta abordagem é particularmente útil para medir a rigidez da aorta ascendente como o comprimento curto da região faz uma medição VOP difícil de obter. O interesse dos pesquisadores existe especificamente na aorta ascendente, porque suas propriedades mecânicas influenciar a perfusão da circulação coronária ea resposta cardíaca à disfunção vascular.
Para medir a relação de pressão de diâmetro da aorta in vivo </em>, a aorta ascendente é visualizado e o seu diâmetro é medido por ultra-sonografia. Pressão sanguínea aórtica é medido de forma invasiva com um cateter de pressão. A pressão arterial é alterada de forma incremental por infusão intravenosa de drogas vasoativas. A fenilefrina contrai os vasos sanguíneos e é usado para elevar a pressão aórtica. O nitroprussiato de sódio dilata os vasos sanguíneos e é utilizado para baixar a pressão aórtica. Diâmetros da aorta sistólica e diastólica e pressões aórtica correspondentes são medidos para cada aumento de pressão. A conformidade pode ser calculado a partir dos dados recolhidos pressão de diâmetro.
Tomando medições de diâmetro em vários incrementos de pressão ao longo de uma ampla gama de valores da pressão é necessário para a caracterização precisa da relação de pressão de diâmetro. Os limites de pressão superior e inferior que podem ser induzidas farmacologicamente pode variar de acordo com o grupo experimental, mas a gama ideal é de cerca de 25 mm Hg a 125 mm Hg e diastólica 50 mm Hg até 200 mm Hg sistólica. As doses de 360 ug / kg / min e PE 240 ug / kg / min SNP provocam geralmente os limites da gama de pressão. No entanto, as doses de PE pode ser aumentada para 480 ug / kg / min e para o SNP 360 ug / kg / min para verificar que os limites tenham sido atingido. As concentrações de trabalho de PE e SNP pode ser diminuído para atingir incrementos de pressão mais finas. À medida que o diâmetro mudará com pressão aórtica, induzindo os mesmos valores de pressão entre os animais e os grupos experimentais não é importante.
Venoso e canulação arterial pode ser realizada em outros locais com o mesmo UOtcomes. Canulação da veia da cauda pode ser um desafio devido ao pequeno tamanho da veia da cauda. Além disso, a veia da cauda não é facilmente visível em ratinhos de cor escura. A veia femoral pode ser canulado como uma alternativa. Esta via pode ser mais fácil desde a veia femoral é mais acessível. Para a inserção do cateter de pressão, além da artéria femoral, o cateter pode ser inserido através da carótida. A artéria femoral é preferível sobre a artéria carótida, no entanto, porque a região do tórax permanece intacto para a imagiologia de ultra-sons. Canulação da artéria femoral pode ser mais difícil porque a artéria femoral é menor. Utilizando um cateter de 1,2 M e a introdução do cateter na artéria femoral proximal abaixo da cavidade abdominal irá facilitar o processo de punção. Colocando algumas gotas de um agente vasodilatador como lidocaína para a artéria femoral ou utilizando um introdutor de cateter também pode ajudar a aumentar o vaso para facilitar a inserção do cateter. O cateter de pressão deve ser manuseado e utilizadode acordo com as instruções do fabricante.
Localização do cateter no interior da aorta não precisa de ser consistente entre os animais, como a queda de pressão no interior da aorta é insignificante. No entanto, a colocação do cateter na aorta abdominal pode ser melhor para minimizar a interferência com a imagiologia de ultra-som da aorta torácica. Alguns mainframes de ultra-som pode gravar pressão em tempo real com o traço M-mode, dando assim uma medida de pressão para cada diâmetro medido no modo-M. Infelizmente, uma vez que o local onde o diâmetro é medido não é o mesmo local onde a pressão é registado, existe um desfasamento entre a pressão registada no cateter e a pressão efectiva na aorta ascendente. Como resultado, só as medições de diâmetro mínimo e máximo podem ser utilizados para a análise de dados.
A principal limitação deste método é a incerteza de medição introduzido pela aorta entrando e saindo of o plano de ultra-sons durante o ciclo cardíaco. Erro introduzido-Motion é comum a todos os estudos de imagem com base, incluindo ressonância magnética e tomografia. Estratégias de compensação incluem o uso de características anatômicas para mudar o quadro de referência com o movimento de 18 e são implementadas durante o processamento de dados. Como software de compensação de movimento não está prontamente disponível, o investigador deve estar vigilante sobre como ajustar a localização da sonda para acompanhar a mudança na localização da aorta como aumento da pressão arterial e diminui. As medições do diâmetro deve também ser tomada através do centro da aorta. No entanto, determinar se o local de gravação do modo-M está a passar através do centro pode ser difícil julgar a imagem de ultra-sons em, especialmente com as posições mutáveis aorta. A incerteza introduzida por essas limitações evidentes no grau de dispersão dos dados, como evidente na Figura 6. A obtenção de uma imagem da secção transversal, em vez do eixo longitudinal da Ascending aorta pode ser uma solução. Entretanto, obter essa visão às vezes pode ser mais desafiador e o traço de modo M resultante pode ser menos clara. A circunferência da secção transversal a partir da imagem em modo B pode ser medido, em vez de o diâmetro da imagem do modo-M. No entanto, determinar quando a circunferência máxima e mínima foi conseguido será limitada pela velocidade de fotogramas em modo B e pode ser mais difícil de avaliar que no modo-M.
Fazendo várias medições da trama de pressão de diâmetro e aumento do tamanho experimental grupo pode melhorar a precisão dos dados. Os dados de pressão de diâmetro podem ser recolhidos a partir de vários locais ao longo do peito. Este protocolo poderia ser efectuado em primeiro lugar com a sonda colocada em um local, com o peito. A aorta iria então ser visualizado com a sonda colocada em um outro local e o protocolo repetido.
Os agentes vasoativos utilizados para modular a pressão arterial poderia afetar potencialmente musc suave aórticatom le, que por sua vez afetam a rigidez. No entanto, a manipulação de pressão aórtica por retorno venoso foi demonstrado que produz alterações semelhantes nos VOP medido invasivamente como manipulação farmacológico em ratos. Estes resultados demonstraram que a infusão de drogas vasoactivas actuam principalmente nas artérias de resistência periférica e não afectam significativamente tono do músculo liso da aorta 19.
Este protocolo pode ser realizada em ratos com algumas pequenas modificações. O peito é raspada antes de aplicar o creme depilatório. A disponível comercialmente 27 G x ½ "cateter é utilizado para a infusão da droga. As doses de medicamentos utilizados para modular a pressão aórtica são 40, 80, e 120 ug / kg / min de PE e 40, 80, e 120 ug / kg / min de SNP.
Além da aorta ascendente, diferenças regionais na rigidez aórtica pode ser determinada com este protocolo. Rigidez Regional medido por esta abordagem seria mais precisa do que a VOP como medições de are retirado de um local como se opor a dois locais para a VOP. No entanto, regiões ao longo da aorta que podem ser medidos com esta técnica são limitados aqueles que podem ser visualizados por ultra-som.
Módulo de elasticidade também podem ser calculados a partir dos dados recolhidos por este método, se uma medição de espessura de parede pode ser obtido. Preciso na medição in vivo da aorta do rato é limitada pelos limites de resolução de tecnologia de ultra-sons actual. Melhoria futura da tecnologia de ultra-som poderia fazer na medição de espessura de parede vivo mais viável. Como alternativa, as medições de espessura pode ser realizado ex vivo. Miografia Pressão iria fornecer as medições mais precisas, porque a espessura pode ser medido a cada incremento de pressão.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Heart, Lung, and Blood Institute grant 1RO1-HL-105296-01 (to D.E. Berkowitz) and an Australian Research Council Grant DP110101134 (to A. Avolio).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
High-resolution ultrasound machine | Visual Sonics | Vevo2100 | |
13-24 MHz transducer | Visual Sonics | MS250 | Used for imaging rats |
22-55 MHz transducer | Visual Sonics | MS550D | Used for imaging mice |
Imaging Station | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
1.2F Pressure catheter | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
SP200 pressure control unit | Transonic | FFS-095-DP01 | |
Standard Infusion Only Harvard Pump 11 Plus syringe pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
Isoflurane vaporizer | VetEquip | 911103 | |
Induction chamber | VetEquip | 941443 | |
100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
Single Stage Brass 0-50 psi General Purpose Cylinder Regulator CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
Fiber optic illuminator & light pipe | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
Supplies | |||
30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | For tail vein cannulation in mice |
Polyethylene Tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | For tail vein cannulation in mice |
27Gx1/2" Surfloe winged infusion set | Terumo | SV*27EL | For tail vein cannulation in rats |
Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Use for ECG recording |
Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Use for ultrasound |
1mL Sub-Q Syringes, 26G x 5/8" | BD | 309597 | |
Nair | Nair | Depilatory cream | |
Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Tissue glue |
Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | 104-S | |
Dumostar P55 fine forceps | Roboz | RS-4984 | |
Microscissors | WPI | 501839 | |
Fine scissors | FST | 14060-11 | |
Medium forceps | Ted Pella | 5665 | |
Hemostatic forceps | Roboz | RS-7131 | |
Non-sterile cotton gauze sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
Cotton tipped applicators | Oritan | 803-WC | |
Label tape | Fisherbrand | 15-901-20 | |
Drugs | |||
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
R-Phenylephrine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6126 | |
Sodium nitroprusside dihydrate | Sigma Aldrich | 71778 | |
Software | |||
Prism | GraphPad | ||
Excel | Microsoft |