نظام Swimmeret من جراد البحر: دليل عملي للتشريح من الحبل العصب وخارج الخلية تسجيلات من نمط للسيارات
Summary
Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.
Abstract
نحن هنا لشرح تشريح جراد البحر البطن الحبل العصبي. إعداد ويضم اثنين من العقد الماضي الصدري (T4، T5) وسلسلة من العقد في البطن (A1 إلى A6). هذه السلسلة من العقد تشمل ذلك الجزء من الجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تقود تحرك منسق من pleopods (swimmerets): النظام swimmeret. ومن المعروف عن أكثر من خمسة عقود أنه في جراد البحر هو الدافع وراء كل swimmeret التي كتبها نمط توليد مستقلة نواة الخاصة التي تولد النشاط بالتناوب الإيقاعي 1-3. الخلايا العصبية الحركية التعصيب عضلات كل swimmeret تشمل اثنين تشريحيا ووظيفيا السكان متميز 4. واحد هو المسؤول عن تراجع (السكتة الدماغية السلطة، PS) من swimmeret. والآخر يدفع إطالة (العودة السكتة الدماغية، RS) من swimmeret. الخلايا العصبية الحركية من النظام swimmeret هي قادرة على انتاج عفويا نمط السيارات الوهمية، وهو مطابق للنمط المسجلة في الجسم الحي </م> 1.
والهدف من هذا التقرير هو إدخال نظام نموذجي للاهتمام ومريحة لدراسة شبكات توليد الإيقاع وتنسيق رقائق مستقلة لدورات المختبر العملي للطلاب. ويتضمن البروتوكول ينص خطوة بخطوة تعليمات لتشريح البطن الحبل العصبي جراد البحر، وتعلق من سلسلة معزولة من العقد، desheathing في العقد وتسجيل swimmerets نمط المحرك الوهمية خارج الخلية من الجهاز العصبي معزولة.
بالإضافة إلى ذلك، يمكننا مراقبة نشاط الخلايا العصبية swimmeret سجلت داخل الخلية من التشعبات. هنا أيضا يمكننا وصف موجز هذه التقنيات وتقديم بعض الأمثلة. وعلاوة على ذلك، مورفولوجيا الخلايا العصبية swimmeret يمكن تقييم باستخدام تقنيات تلوين مختلفة. نحن هنا تقديم أمثلة من داخل الخلايا (عن طريق الرحلان الشاردي) صبغ شغل في الخلايا العصبية وbackfills من برك من الخلايا العصبية الحركية swimmeret. في مختبرنانستخدم هذا التحضير لدراسة وظائف أساسية للتنقل الوهمية، وأثر من ردود الفعل الحسي على نشاط الجهاز العصبي المركزي، والتنسيق بين رقائق على المستوى الخلوي.
Introduction
وswimmerets من جراد البحر تخدم وظيفة في السيطرة الموقف وضربت بشكل متوازن عندما تسبح الحيوانات إلى الأمام، تهوية الجحور أو الإناث بيضها تهوية 5 و 6. وswimmerets من جراد البحر إشارة، Pacifastacus leniusculus، تحدث في أزواج من الثاني إلى الخامس الجزء البطن، مع أطرافهم واحدة على كل جانب من البطن 7. ينتج الجهاز العصبي المركزي على الخاص طقطق محركها الإيقاعي الذي يحرك حركة swimmeret في الحيوان سليمة وكذلك في إعداد الحبل العصبي معزولة. عندما لا يكون هناك ردود الفعل الحسية أو تنازلي المدخلات الحالي يسمى النمط الإيقاعي السيارات المنتجة تنقل الوهمية 1 و 2. وفي النظام swimmeret لا يختلف هذا النمط الحركي في أي معلمة من نشاط swimmerets قياس في الحيوان سليمة.
هو الدافع وراء حركة كل swimmeret من قبل المتناهية الصغر التي يقع في ويقتصر على واحدة جorresponding hemiganglion 1 – 3 في كل المتناهية الصغر هناك نمط توليد نواة والتي تضم خمسة interneurons غير ارتفاعه تحديدها. أنها يمكن أن توصف وظيفيا على أنها إما المانع من السكتة الدماغية الطاقة (IPS) أو المانع من العودة السكتة الدماغية (IRS) 8. هذه IPS وinterneurons IRS ليست مؤشرات التذبذب الذاتية، وليس هو الدافع وراء النشاط بالتناوب من خلال تثبيط متبادل 9. لأن هذه interneurons تمنع الخلايا العصبية الحركية swimmeret مباشرة، يتم إنشاء بالتناوب حركة PS-RS 10. تنقل ومع ذلك، لا تتطلب سوى توليد النشاط، ولكن أيضا التنسيق بين رقائق مستقلة مختلفة. في النظام swimmeret يتم تأسيس مثل هذا التنسيق من قبل المتناهية الصغر تنسيق الذي يضمن أن أطرافه تنشط في الأوقات الصحيحة. تم بناء هذا المتناهية الصغر من قبل ثلاثة الخلايا العصبية التي تم تحديدها في كل قطعة 11-15.
يوفر هذا البروتوكول لعشرالبريد أول مرة دليلا تشريح خطوة بخطوة لعزل سلسلة من العقد (T4 إلى A6، الشكل 1). وتبين لنا كيفية يعلقون عليه معزولة في البطن الحبل العصبي وdesheathe كل عقدة. في هذا معزولة إعداد الجهاز العصبي، الخلايا العصبية المسؤولة عن الحركة swimmeret جاهزة للاستخدام في التجارب الكهربية والصرفية. الجزء الثاني من هذا البروتوكول يوضح الملامح الرئيسية لنمط المحرك swimmeret. ويشمل هذا دليل خطوة بخطوة لتسجيل خارج الخلية من نشاط الخلايا العصبية الحركية swimmeret. محاور الخلايا العصبية الحركية RS المشروع من خلال فرع الأمامي من N1 العصبية، في حين تتوقع بعض محاور الخلايا العصبية الحركية PS من خلال فرع الخلفي من نفس العصب (الشكل 1) 4. لذا نشاطهم يمكن تسجيل من هذه الفروع مع أقطاب دبوس التفاضلية.
<br/> الشكل 1: المعزولة الجهاز العصبي من العقدة الصدرية 4 (T4) إلى العقدة في البطن 6 (A6) والرسم التخطيطي منه T4: العقدة الصدرية 4؛ T5: العقدة الصدرية 5؛ A1، A2 … A6 العقدة في البطن 1، العقدة في البطن 2 … العقدة في البطن 6؛ N1: العصبية N1. N2: العصبية N2. N3: العصبية N3. PS: السلطة السكتة الدماغية. RS: عودة-السكتة الدماغية. الاختصارات الاتجاه: A = الأمامي. P = الخلفي.
هذا الإجراء تشريح وتقنية الكهربية أثبتت ومريحة لطلاب المرحلة الجامعية ويمكن أن تكمل الدورات العملية طالب في علم وظائف الأعضاء. وقد استخدم سلسلة معزولة من العقد في عدد من التجارب لدراسة العصبي وظيفة الجهاز، والتنسيق، أو تعديل من رقائق swimmeret 6 فضلا عن السيطرة العصبية من السلوك التكيفي في تنقل 16، 17. وهكذا فإن نظام جراد البحر swimmeret يوفر وجود كمية هائلة التدريس مثيرة للاهتمام أو تيتمطر الفرص التي تبدأ مع كل تشريح الحبل العصبي البطني من جراد البحر وتسجيل خارج الخلية من نمط السيارات الوهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت تشريح جراد البحر والعقد من البطن سابقا 5 و 18 و 19 و 20 و فمن المستحسن أن تصبح على دراية بها قبل تشريح من أجل تجنب قطع الأعصاب الهامة.
ومن الأهمية بمكان للحفاظ على التحضير في درجة حرارة أقل من 23 درجة مئوية إلى من?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جوس Burgert لمساعدة مع بعض الشخصيات. ونحن ممتنون لإنغو Selbach (ومجموعة "Edelkrebsprojekt NRW") لجهوده الرامية إلى تزويد المختبر مع حيوانات التجارب. نشكر آنا C. شنايدر لتصحيح التجارب المطبعية الإصدارات الأولى من المخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل منحة SM إيمي نويثر DFG 206 / 3-1 ومنحة بدء التشغيل من جامعة كولونيا لأعضاء هيئة التدريس من الإناث.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Type | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| 4-channel extracellular amplifier: MA 102 | Amplifier | Elektroniklabor, Zoologie, Universität zu Köln, Germany | for extracellular recording | |
| air-table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA |
63-534 | for intracellular recording | |
| Axon Digidata 1440A | Digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA | DD1440A | digitizes recorded signals |
| big bucket | filled with ice | |||
| Clampex & Clampfit | pClamp 10, recording and analysis software | Molecular Devices Design, Union City, CA | pClamps 10 Standard | for extracellular recording |
| cold lamp source | with flexible light guide (fiber optic bundle) | Euromex microscopes holland, Arnhem, BD | LE.5211 & LE.5235 | |
| computer and monitor | equipped with recording software | for extracellular recording | ||
| container and pipette for liquid waste | ||||
| crayfish saline | contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4. | always keep at temperatures ~ 4° C | ||
| dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable) | fluorescent dye, lysine fixable | Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany | D3328 | for intracellular dyefill of neurons |
| differential pin electrodes | made from stainless steel ɸ 0.2 mm | for extracellular recording | ||
| dissection dish | (l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone | used in the gross disection | ||
| faraday cage | for extracellular recording | |||
| fixing pins | for pinning the specimen | |||
| forceps (biology, Dumont #5) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11252-20 | fine forceps: used to pick nerves |
| forceps (biology, Dumont #55) | Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11255-20 | extra fine forceps: used for desheathing |
| forceps (electronic, Dumont #5) | Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX | Fine Science Tools (FST), Germany | 11251-20 | coarse forceps: used to grab specimen and pins |
| intracellular electrode | Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament | Sutter Instruments, Novato, CA | BF100-50-10 | for intracellular recording and dyefill of neurons |
| Leica S8 Apo StereoZoom | Dissection Microscope Zoom 1x – 8x | Leica, Germany | 10446298 | for extracellular recording |
| microscope table | for extracellular recording | |||
| mirror | to illuminate preparation from below | for extracellular recording | ||
| modeling clay | for extracellular recording | |||
| Olympus SZ61 | Dissection Microscope Zoom 0.67x – 4.5x | Olympus, Germany | for the dissection | |
| petri dish | 94 x 16 mm; lined with clear silicone | Greiner bio-one, Germany | 633180 | used to pin the isolated chain of ganglia |
| ring scissors | ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 14054-13 | for gross dissection (steps 2.1 – 2.11) |
| saline dispenser with a 16 gauge needle (outer ɸ 1.6mm) attached via a flexible tube. | Volume ~ 60ml, | used for exsanguination | ||
| spring scissors or alternative: Vannas spring scissors | cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 15024-10 or 15000-08 | for desheathing |
| stainless steel wire ɸ 0.125 mm | to cut pins of 4-7 mm length | Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany | for pinning of the nerve cord | |
| student Vannas spring scissors or alternative: Moria Spring Scissors | cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm | Fine Science Tools (FST), Germany | 91500-09 or 15396-00 | for gross and fine disection (steps 2.11 – 3.14) |
| sylgard | 184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon | Dow Corning, Midland, MI, USA | ||
| syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip | for extracellular recording |
References
- Hughes, G. M., Wiersma, C. A. G. The Co-Ordination of Swimmeret Movements in the Crayfish, Procambarus-Clarkii (Girard). J Exp Biol. 37 (4), 657-670 (1960).
- Mulloney, B., Smarandache, C. Fifty Years of CPGs: Two Neuroethological Papers that Shaped the Course of Neuroscience. Front Behav Neurosci. 4, 45 (2010).
- Murchison, D., Chrachri, A., Mulloney, B. A Separate Local Pattern-Generating Circuit Controls the Movements of Each Swimmeret in Crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2620-2631 (1993).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Functional organization of crayfish abdominal ganglia. III. Swimmeret motor neurons. J Comp Neurol. 419 (2), 233-243 (2000).
- Davis, W. J. Lobster Righting Responses and Their Neural Control. Proc R Soc Ser B-Bio. 170 (1021), 435-456 (1968).
- Mulloney, B., Smarandache-Wellmann, C. Neurobiology of the crustacean swimmeret system. Prog Neurobiol. 96 (2), 242-267 (2012).
- Huxley, T. H. . The crayfish: An introduction to the study of zoology. , (1980).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Wright, T. M., Mulloney, B. Five types of nonspiking interneurons in local pattern-generating circuits of the crayfish swimmeret system. J Neurophys. 110 (2), 344-357 (2013).
- Skinner, F. K., Mulloney, B. Intersegmental coordination of limb movements during locomotion: mathematical models predict circuits that drive swimmeret beating. J Neurosci. 18 (10), 3831-3842 (1998).
- Mulloney, B. During fictive locomotion, graded synaptic currents drive bursts of impulses in swimmeret motor neurons. J Neurosci. 23 (13), 5953-5962 (2003).
- Smarandache-Wellmann, C., Grätsch, S. Mechanisms of coordination in distributed neural circuits: Encoding coordinating information. J Neurosci. 34 (16), 5627-5639 (2014).
- Mulloney, B., Hall, W. M. Local commissural interneurons integrate information from intersegmental coordinating interneurons. J Comp Neurol. 466 (3), 366-376 (2003).
- Mulloney, B., Harness, P. I., Hall, W. M. Bursts of information: Coordinating interneurons encode multiple parameters of a periodic motor pattern. J Neurophys. 95 (2), 850-861 (2006).
- Smarandache, C., Hall, W. M., Mulloney, B. Coordination of Rhythmic Motor Activity by Gradients of Synaptic Strength in a Neural Circuit That Couples Modular Neural Oscillators. J Neurosci. 29 (29), 9351-9360 (2009).
- Smarandache-Wellmann, C., Weller, C., Mulloney, B. Mechanisms of Coordination in Distributed Neural Circuits: Decoding and Integration of Coordinating Information. J Neurosci. 34 (3), 793-803 (2014).
- Chrachri, A., Neil, D., Mulloney, B. State-Dependent Responses of 2 Motor Systems in the Crayfish, Pacifastacus leniusculus. J Comp Physiol A. 175 (3), 371-380 (1994).
- Chrachri, A., Neil, D. M. Interaction and Synchronization between 2 Abdominal Motor Systems in Crayfish. J Neurophys. 69 (5), 1373-1383 (1993).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) II. Synaptic Neuropils. J Comp Neurol. 234 (2), 182-191 (1985).
- Skinner, K. The Structure of the 4th Abdominal-Ganglion of the Crayfish, Procambarus-Clarki (Girard) I. Tracts in the Ganglionic Core. J Comp Neurol. 234 (2), 168-181 (1985).
- Mulloney, B., Tschuluun, N., Hall, W. M. Architectonics of crayfish ganglia. Microsc Res Techniq. 60 (3), 253-265 (2003).
- Braun, G., Mulloney, B. Cholinergic modulation of the swimmeret motor system in crayfish. J Neurophys. 70 (6), 2391-2398 (1993).
- Davis, W. J. Motoneuron Morphology and Synaptic Contacts – Determination by Intracellular Dye Injection. Science. 168 (3937), 1358-1360 (1970).
- Altman, J. S., Tyrer, N. M., Strausfeld, N. J., Miller, T. A. Filling Selected Neurons with Cobalt through Cut Axons. Neuroanatomical Techniques. , 373-402 (1980).
