Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage.
Hier präsentieren wir eine Methode zur langfristigen Zeitraffer-Bildgebung von lebenden embryonalen Maus Cochlea Explantate. Das Entwicklungsprogramm für den Bau des hochgeordnete, komplexe Struktur der Säuger Cochlea Erlös für rund 10 Tage verantwortlich. Um Veränderungen in der Genexpression in diesem Zeitraum, und ihre Reaktion auf pharmazeutische oder genetische Manipulation zu untersuchen, ist die Langzeitabbildungs notwendig. Zuvor wurde die Bildgebung in der Regel durch die Lebensfähigkeit von explantierten Gewebes in einer feuchten Kammer auf einem Standardmikroskop beschränkt. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung optimaler Bedingungen für das Kulturwachstum in Bezug auf Feuchtigkeit und Temperatur hat Grenzen für die Länge des Abbildungsexperimente platziert. Ein in einen modifizierten Gewebekultur-Inkubator integrierten Mikroskop bietet ein hervorragendes Umfeld für langfristig-Live-Bildgebung. Bei dieser Methode zeigen wir, wie die embryonale Maus Cochlea Explantate zu etablieren und wie man einen Inkubator Mikroskop verwenden, um Zeitraffer Imagi leitenng unter Verwendung sowohl Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie, um das Verhalten eines typischen embryonalen Tag (E) 13 Cochlea Explantat und Sox2, einem Marker der prosensory Zellen der Cochlea, über 5 Tage zu untersuchen.
Die Säugetier Cochlea ist eine hochgeordnete komplexes Organ. Bei der Maus zwischen der Entstehung des primitiven Innenohr aus dem Ohrbläschen am Tag E11 und die Fertigstellung des Entwicklungsprogramms der frühen postnatalen Stadien, mehrere Wellen der Zellsignalisierung und koordinierte Veränderungen in der Genexpression statt. Laufen von der Basis bis der Ductus cochlearis Apex ist die Geräuscherfassungs Sinnesepithel oder Corti-Organ. Entwicklung des Corti-Organ ist vorzüglich so gesteuert, dass am Ende der Entwicklung, wird es aus einer einzigen Reihe von inneren Haarzellen bestehen, drei Reihen von äußeren Haarzellen mit fünf Reihen von Stützzellen (zwei Reihen von Säulenzellen, drei setzt Reihen von Deiters 'Zellen) ein. Abweichung von dieser genauen Reihenfolge ergibt Hörverlust, heighlighting die Bedeutung der studye OFTHE Entstehung und Strukturierung der sensorischen epithemlium 2.
In-vitro-Kultivierung von embryonalen Maus cochlea ist ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung der Mechanismen der Entwicklung des Corti-Organ. Diese Technik wurde 1974 gegründet und in den letzten 40 Jahren verwendet worden, um viele der Mechanismen, mit denen die sensorische Epithel angegeben ist und der Corti-Organ gegründet 3 aufzuklären. Die Cochlea ist ein komplexes Organ mit dynamischen Entwicklungsprozesse; eine Manipulation kann so lange wie sieben Tage manifestieren 1. Zum Beispiel, wenn das Hinzufügen GSK 3β-Inhibitoren zu einer Cochlea Explantatkultur in E13 die optimale Inkubationszeit zu beobachten, eine robuste Wirkung der Verbindung sechs Tagen 4.
Echtzeit-Bildgebung des Entwicklungs Cochlea ermöglicht Untersuchung Veränderungen in der Morphologie des Corti-Organ, Veränderungen in der Genexpression, Verfolgung von Tierwanderung, wuchernden oder sterbenden Zellen und ermöglicht Echtzeit-Beobachtung der Ergebnisse von pharmazeutischen Wirkstoffen und die Störung der Signal Wegen. Bisher leben Bildgebung der Cochleawurde hauptsächlich durchgeführt unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um Bild kleine Bereiche des Corti-Organ über kurze Zeiträume 5-8, aber diese Technik hat Einschränkungen aufgrund Explantat Lebensfähigkeit. In Abbildung der Auswirkungen von Langzeitmanipulationen an langsame Entwicklungsprozessen ist die Abbildungsumgebung entscheidend. Typischerweise verwendet ein konfokales Live-Bildgebungssystem einen befeuchteten Kunststoffbox, die am Mikroskop sitzt. Hitze und Feuchtigkeit kann durch die Lücken in dem Inkubieren Feld trifft dort auf den Mikroskoptisch, durch den Zugriffsfenstern, durch die Scharnieröffnungen und durch die Lücken um verschiedene Teile des Mikroskop- wie dem Ziel oder der Lichtquelle entweichen. Dies ist nicht optimal für die Gesunderhaltung der Explantate für mehr als zwei oder drei Tage.
Wir definieren "Inkubator Mikroskops als invertiertes Mikroskop in einem Standard-CO 2 -Inkubator abgedichtet, anstatt einem Inkubator auf der Mikroskop aufgebaut. Ein Inkubator Mikroskop exneigt die Lebensdauer des Experiments, dass anstatt Abbildungs über zwei oder drei Tage, können die Proben für bis zu zwei Wochen abgebildet werden. Ein Inkubator Mikroskop eine ausgezeichnete Umgebung für das Zellwachstum und Differenzierung, mit minimaler Störung zu Kulturen und Standard kontrollierten Bedingungen Explantation. In Studien, die über mehrere Tage stattfinden, ist es üblich, den Abbildungsproben auf einer täglichen Basis, indem sie aus dem Inkubator entfernt und trägt sie zu einem invertierten Fluoreszenzmikroskop greifen. Während dieser Ansatz funktionieren kann, das Entfernen der Gerichte aus dem Inkubator zufügt Belastung der empfindlichen Entwicklungs Gewebe. Änderungen der Säuregehalt des Kulturmedium und Temperaturschwankungen aufgrund der Entnahme aus dem Inkubator in suboptimalen Entwicklung und ungesunden Gewebes führen. Abbilden der gleichen Region auf der gleichen Brennebene und in der gleichen Orientierung zu jedem Zeitpunkt ist eine große Herausforderung. Durch die Verwendung eines automatisierten Systems in einem Inkubator ist es möglich gesund zu haltenGewebe, um Bilder bei mehreren Zeitpunkten zu sammeln und um sicherzustellen, dass derselbe Bereich in jedem Rahmen erfasst. In den letzten Jahren mehrere integrierte Mikroskop Gewebe Brut entwickelt, diese nicht nur in der klinischen Praxis 9 aber auch in Stammzellen und Krebsforschung 10,11 nützlich.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für langfristig Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Cochlea-Explantate. Wir verwenden eine automatisierte Mikroskopie System innerhalb einer Standard CO 2 Inkubator, die die Fähigkeit, Bilder von mehreren Proben in festgelegten Zeitpunkten zu erfassen hat. Das System besteht aus einem inversen Mikroskop innerhalb Inkubator gesetzt. Proben werden in einem rotierenden Podest, das Bildgebung mehrerer Proben ermöglicht zu jedem Zeitpunkt platziert. Beleuchtung, Bildaufnahme und Drehung des Podiums werden durch ein automatisiertes System durch Metamorph-Software betrieben gesteuert. Durch das Setzen eines bilderzeugenden Routine mit der Bediensoftware können wir einen Versuchsaufbau für bis zu tw laufeno Wochen mit minimaler menschlicher Intervention. In diesem Beispiel verwenden wir sowohl Hellfeld und Fluoreszenz zu großen Wachstum und Umlagerung der Cochlea, und insbesondere die prosensory Region zeigen. In diesem Experiment wird cochleae von Sox2 EGFP Reportermäuse an embryonalen Tag E13 seziert werden. In vitro-Kulturen wird aufgebaut und dann über fünf Tage abgebildet.
Es gibt mehrere technische Punkte, die bei Kulturen festgelegt und bei der Einrichtung der Zeitraffer-Mikroskop, um für langfristige Bildgebung.
Wir verwenden Basalmembranmatrix als Substrat zum Kultivieren von Cochlea-Explantate, doch sollte das Substrat für den Zelltyp abgestimmt werden. Zum Beispiel, um Bild neuronalen Kulturen, kann es besser sein, eine Fibronectin-Beschichtung bereitzustellen. Inkubation Temperatur und Gaszusammensetzung auch nach Gewebetyp gewählt werden. Wahl des A…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Ihnen, Willy Sun für die technische Unterstützung und Dr. Kris Gellynck für hilfreiche Anmerkungen und drei anonymen Gutachtern für ihre konstruktive Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative gefördert
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