The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
Les astrocytes sont des cellules gliales omniprésents et abondantes du cerveau. Il est bien établi que les astrocytes servent soutien vital et rôles homéostatiques y compris tampon de concentration de K + dans l'espace extracellulaire, recaptage des neurotransmetteurs, ainsi que fournir des éléments nutritifs. Cependant, des études récentes montrent qu'ils affichent aussi [Ca2 +] i signaux, qui se produisent spontanément et sont augmentés de l'activité neuronale 1. L'existence d'astrocytes [Ca 2+] i la signalisation a été de plus en plus pensé à déclencher leur communication avec les neurones, et en tant que tel a été interprétée comme une forme de "Ca 2+ excitabilité" dans les astrocytes. Les données disponibles au cours des deux dernières décennies suggèrent deux contextes dans lesquels les astrocytes et les neurones peuvent communiquer, peut-être d'une manière bidirectionnelle. Tout d'abord, les astrocytes réagissent souvent avec une augmentation de la [Ca 2+] i lorsqu'il est activé par les neurotransmetteurs etneuromodulateurs libérés par les neurones 2. Deuxièmement, [Ca 2+] i augmente dans les astrocytes provoquer la libération de molécules de signalisation des astrocytes qui peuvent à leur tour affecter les neurones et les vaisseaux sanguins. Les preuves suggèrent que les molécules libérées par les astrocytes conduisent à des changements dans les fonctions de synapses, les circuits et en fin de compte le comportement de signalisation par l'intermédiaire de 3 à 5 astrocyte-à-neurone. Cependant, cela reste un domaine de recherche en plein développement, et il a été avancé que d'une meilleure compréhension et détaillée des astrocytes [Ca 2+] i est nécessaire pour résoudre certaines des incertitudes actuelles 6.
Dans le travail passé, il a été démontré que le chargement en vrac de Ca 2+ organiques colorants indicateurs dans les astrocytes ne parvient pas à détecter de manière fiable [Ca 2+] i signaux dans les astrocytes entiers de la culture et in situ 7-10. Ces résultats ont été discutés par nous et d'autres 6,11,12. Le Emerging image est que [Ca 2+] i signaux au sein des processus d'astrocytes (par exemple, les branches et rameaux), qui sont les premiers sites d'interactions avec les neurones et les vaisseaux sanguins, ont rarement été étudiée en détail. Récemment, l'utilisation d'indicateurs de calcium génétiquement codées (GeCIS) comme GCaMP3 cytosolique, GCaMP5G et GCaMP6 et membrane plasmique versions captif (par exemple, Lck-GCaMP3) a permis l'étude de [Ca 2+] i signaux dans de petits compartiments de astrocytes ces processus minces, près de la membrane plasmique et dans des territoires entiers 7,8. Cependant, GeCIS ont un inconvénient plus organiques Ca 2+ colorants indicateurs et qui est l'exigence des méthodes génétiques pour livrer les gènes codant sélective pour les astrocytes in vivo pour des périodes de plusieurs semaines pour la GeCIS être appropriée exprimé. Expression in vivo est généralement réalisé en utilisant des souris transgéniques, souris knock-in ou par le virus basé livraison appcafards. Dans l'article présent JoVE nous présentons les méthodes et procédures utilisées pour fournir GeCIS à astrocytes striataux utilisant des virus adéno-associés. Nous nous concentrons sur cyto-GCaMP3 comme un exemple, mais la même procédure de base fonctionne pour tout autre GECI ou fluorescent reporter à base de protéines.
Les méthodes décrites ici nous ont permis d'exprimer cyto-GCaMP3 dans les astrocytes du striatum in vivo pour la suite [Ca 2+] i imagerie in situ. Cette méthode a des avantages sur l'aide transgénique ou souris knock-in, y compris l'expression robuste de la protéine ciblée, la rapidité et la souplesse de mise en œuvre expérimentale et la spécificité anatomique. L'expression de GCaMP3 utilisant VAA2 / 5 a été trouvé pour être plus précis et robuste. …
The authors have nothing to disclose.
La majorité des travaux et le personnel impliqués ont été pris en charge par le NIH subvention NS060677 et en partie par les NIH accorde MH099559 et MH104069 (à BSK). Une partie du travail a également été soutenu par la Fondation CHDI.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |