Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
Glutamat-Rezeptoren vermitteln die Mehrheit der erregenden synaptischen Transmission an Synapsen des zentralen Nervensystems. Die beiden wichtigsten Subtypen von ionotropen Glutamat-Rezeptoren an der Wirbelsäule Kopf der postsynaptischen Membran lokalisiert sind N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren. Bei Ruhemembranpotentiale, AMPA-Rezeptoren tragen die meisten der postsynaptischen Strom während der synaptischen Übertragung. Im Hippocampus spielt der NMDA-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Änderungen der Anzahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran: durch ein "Koinzidenz-Detektor" 1 wirkenden Änderungen der synaptischen Stärke 1 einzuleiten, nimmt der NMDA-Rezeptor in den synaptischen Mechanismen , die gedacht werden, um Lernen und Gedächtnis bei einem subzellulärer Ebene zu untermauern. In Reaktion auf die Depolarisation der postsynaptischen Neuron parallel präsynaptischen Transmitterfreisetzung tritt Kalzium über den NMDARezeptor AMPA-Rezeptor Einsetzen oder Entfernen 2 einzuleiten. Diese Rezeptordynamik zugrunde liegen Synapse Plastizität: eine Erhöhung der synaptischen Stärke ist Langzeit-Potenzierung 2,3 (LTP), während eine Abnahme der synaptischen Stärke ist die langfristige Vertiefung 4 (LTD). Daher AMPA-Rezeptor Bewegung gedacht für die synaptische Plastizität Expression verantwortlich zu sein, während NMDA-Rezeptoren wird angenommen, dass seine Induktion zu steuern.
Die Bestimmung der genauen Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zugrunde liegenden erfordert das Studium kleinen Populationen von Synapsen, idealerweise einzelne Synapsen. Während einige Synapsen sind sehr für Studie aufgrund der kleinen und diffuse Art der synaptischen Verbindungen geeignet auf dieser Ebene, zB der Kelch der gehaltene 5, für die meisten Populationen synaptischen das ist extrem schwierig. Zwei Hauptelektro Techniken entwickelt worden, um einzelne synaptischen Verbindungen zu untersuchen: Die erste ist eine minimale Stimulation where eine präsynaptischen Faser wird vermutet, stimuliert extrazellulär. Die zweite Technik gepaart Aufnahmen, wo zwei gleichzeitige Aufnahmen von ganzen Zelle synaptisch verbundenen Neuronen durchgeführt wird. Ein wesentlicher Vorteil der minimalen Stimulations ist, dass es schnell und relativ einfach durchzuführen, mit Platzierung einer extrazellulären Stimulationselektrode in das axonale Trakt, während gleichzeitig der Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron. Das Hauptanliegen bei der Verwendung dieser Technik ist, dass zuverlässige Stimulation einer einzelnen Zelle nur selten gewährleistet Studie nach Studie werden.
Im Laufe der letzten fünfzehn Jahre haben wir routinemäßig verwendet zwei synaptisch verbunden Pyramidenzellen 6-17 gepaart Ganzzellableitungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass nur eine präsynaptische Neuron konsistent und zuverlässig stimuliert. Außerdem können nicht nur elektro Charakterisierung auch pharmakologische Manipulation der präsynaptischen Neuron 6,18 </ Sup>. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen gering, so verbundenen Paaren schwierig bis 19 zu erhalten. Die Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen umgeht dieses Hindernis als synaptischer Verbindungen wieder hergestellt werden kann in vitro und außerdem die Art der resultierenden Verbindungs ist ähnlich zu der des natürlichen Gehirngewebe 20. Darüber hinaus organotypischen Kulturen auszudrücken LTP, LTD 7-10,12-15,21 und weitere Formen der kurzfristigen synaptischen Plastizität gepaart mit Puls-Erleichterung (PPF) und Depression (PPD) 6,22,23, so dass Plastizität Mechanismen zur in Paaren von Neuronen untersucht werden. Hier beschreiben wir die detaillierte Methode erfolgreich erreichen gepaart Aufnahmen in diesem in vitro-System beteiligt. Diese Information kann leicht in anderen experimentellen Systemen, einschließlich akuter Scheiben und anderen Hirnregionen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir die Voraussetzungen für die Gründung erfolgreich gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen beschrieben. Gepaart Aufzeichnungen können auch in mehreren Präparaten, einschließlich akute Scheiben und dissoziiert Kultursysteme 26,27 durchgeführt werden. Während der Fokus hier ist auf die Induktion von mehr Formen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD nämlich) gewesen ist, ist es wichtig zu betonen, dass gepaart ganze Zellableitungen in organotypisch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
