आठ दिनों के आयु वर्ग के एक माउस के तंत्रिका रेटिना एक 4% जिलेटिन ब्लॉक के शीर्ष पर है। Vibratome द्वारा फोटोरिसेप्टर परत (200 माइक्रोन) के अलगाव के बाद, फोटोरिसेप्टरों संस्कृति के लिए यांत्रिक और enzymatic हदबंदी के बाद वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। फोटोरिसेप्टर परत आणविक, जैव रासायनिक विश्लेषण या प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
रेटिना प्रकाश की दिशा पर विचार रेटिना पर सबसे दूर भाग में रेटिना pigmented उपकला साथ, फोटोरिसेप्टर से परतों में न्यूरॉन्स के साथ, संपर्क में दोनों छड़ और शंकु वास्तुकला का आयोजन किया गया है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का एक हिस्सा है, और सबसे समीपस्थ दूरी में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं। इस वास्तुकला vibratome सेक्शनिंग द्वारा फोटोरिसेप्टर परत के अलगाव की अनुमति देता है। आठ दिनों के आयु वर्ग के एक माउस के विच्छेदित तंत्रिका रेटिना फ्लैट एम्बेडेड है नीचे का सामना करना पड़ 20% जिलेटिन फोटोरिसेप्टर परत का एक टुकड़ा के शीर्ष पर 4% जिलेटिन में। एक vibratome और एक डबल धार धार का प्रयोग, 100 माइक्रोन मोटी भीतरी रेटिना sectioned है। इस अनुभाग में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और विशेष रूप से द्विध्रुवी कोशिकाओं के साथ भीतरी परत में शामिल है। फोटोरिसेप्टर युक्त बाहरी रेटिना के 200 माइक्रोन बरामद किया है इससे पहले 15 माइक्रोन का एक मध्यस्थ खंड खारिज कर दिया है। जिलेटिन 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा हटा दिया जाता है। बाहरी परत के टुकड़े incuba हैं37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सक्रिय papain की दो इकाइयों के साथ घंटी समाधान के 500 μl में टेड। प्रतिक्रिया Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 500 μl 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) जोड़कर बंद कर दिया है, DNase मैं तो 25 इकाइयों सीरम दूर करने के लिए, आरटी पर centrifugation से पहले कई बार धोया जोड़ा जाता है और कोशिकाओं में resuspended 500 DMEM के μl और / 2 सेमी 1 x 10 5 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त। कोशिकाओं इन विट्रो में 5 दिनों के लिए बड़े हो रहे हैं और उनकी व्यवहार्यता लाइव / मृत परख का उपयोग रन बनाए। संस्कृति की पवित्रता पहले प्रयोग के दौरान सूक्ष्म अवलोकन द्वारा निर्धारित किया जाता है। पवित्रता तो बोने और एक ऊतकीय स्लाइड पर कोशिकाओं फिक्सिंग और एक खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी शिथिलता, एक फोटोरिसेप्टर मार्कर और माउस मोनोक्लोनल विरोधी रो, एक रॉड फोटोरिसेप्टर विशिष्ट मार्कर का उपयोग का विश्लेषण द्वारा मान्य है। वैकल्पिक रूप से, फोटोरिसेप्टर परत (97% की छड़) जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए और प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
रेटिना रीढ़ के बीच एक संरक्षित वास्तुकला है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का एक अभिन्न हिस्सा है। तंत्रिका रेटिना के न्यूरॉन्स घटना प्रकाश, आंख के पीछे की रेटिना pigmented उपकला (RPE) के साथ निकट संपर्क में फोटोरिसेप्टर परत के लिए सबसे दूर के साथ, परतों में आयोजित कर रहे हैं। रॉड और कोन photorecptors फोटोन को पकड़ने के लिए opsin संवेदनशील अणुओं पर निर्भर है कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील कोशिकाएं हैं। इन अणुओं RPE के एक अंक की दिशा में जो फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंड पर स्थित एक सेलुलर संरचना की डिस्क झिल्ली, पर संलग्न हैं। सबसे अधिक बार बहुत जल्दी फोटोरिसेप्टर degenerations के मामलों में प्रभावित होता है, जो इस संरचना, 10% हर दिन की दर से नए सिरे से है। तथाकथित भीतरी परत फोटोरिसेप्टरों, द्विध्रुवी, amacrine और क्षैतिज कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं से प्राप्त संकेत गणना कि अन्य न्यूरॉन्स के सबसे शामिल हैं। उनके axons के साथ इन बादऑप्टिक तंत्रिका है जो एक किरण के रूप में। इस layering कोशिकाओं भीतरी plexiform परत 2 के बाहर पाए जाते हैं जब जीव के कार्यकाल विस्थापित amacrine कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है इतना है कि संरक्षित है। न्यूरॉन्स की परतें रेडियल मुलर glial कोशिकाओं का एक कवच के भीतर वितरित कर रहे हैं। द्विध्रुवी कोशिकाओं नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को फोटोरिसेप्टर लिंक। वे बाहरी plexiform परत और भीतरी plexiform परत के बीच स्थित हैं। नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं द्विध्रुवी कोशिकाओं के सिलसिले में आंतरिक plexiform परत के रूप में। amacrin कोशिकाओं द्विध्रुवी कोशिकाओं और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के बीच आंतरिक plexiform परत में स्थित एसोसिएशन कोशिकाओं के रूप में नामित कर रहे हैं। बाहरी plexiform परत क्षैतिज सेल शामिल हैं। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के न्यूरोनल परतों की इस अनूठी व्यवस्था एक vibratome का उपयोग फ्लैट घुड़सवार रेटिना टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा आंतरिक सेल परत से फोटोरिसेप्टर परत के अलगाव परमिट।
मूल रूप से, इस तकनीक ट्रॅन के लिए फोटोरिसेप्टरों अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाrd1 माउस, मानव रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) 3 के एक मॉडल की नजर में splantation। rd1 माउस रॉड-विशिष्ट फॉस्फोडाइस्टरेज़ बीटा सबयूनिट के लिए encodes जो Pde6b जीन में एक अप्रभावी उत्परिवर्तन वहन करती है। मनुष्य के चार में आरपी में इस जीन परिणाम के पीछे हटने का म्यूटेशन। रॉड फोटोरिसेप्टर degenerated है, के बाद रोगी रात दृष्टि खो देता है, और, उत्परिवर्तित जीन व्यक्त एक दूसरे कदम के रूप में पतित नहीं है जो आश्चर्यजनक रूप से कोन फोटोरिसेप्टर,। शंकु रंग दृष्टि और दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक हैं, क्योंकि रोगियों उत्तरोत्तर अंधे हो जाते हैं और रोग के लिए एक प्रभावी उपचार अभी तक विकसित नहीं किया है। एक जंगली प्रकार माउस से मेजबान माउस के कोन अध: पतन फोटोरिसेप्टर परत कलम बांधने का काम करके 3,5 देरी हो रही है। छड़ और द्विध्रुवी कोशिकाओं के बीच synaptic कनेक्शन केवल आर के एक विशिष्ट चरण में प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि रॉड-कोन अपक्षयी मॉडल में खो छड़ एक प्रत्यारोपण से नहीं बदला जा सकता हैएनआरएल अभिव्यक्ति 6 की शुरुआत से चिह्नित etinal विकास,। फोटोरिसेप्टर की परत RPE और शेष फोटोरिसेप्टरों, शंकु का केवल 3% करने के लिए इसी बाहरी रेटिना के बीच, रॉड-कम rd1 रेटिना के उप रेटिना अंतरिक्ष में शल्य चिकित्सा द्वारा शुरू की है। दो हफ्ते सर्जरी के बाद, एक सामान्य फोटोरिसेप्टर परत के साथ प्रत्यारोपित पशु से शंकु का 40%, या दिखावा संचालित पशु को भीतरी रेटिना की कोशिकाओं का एक सामान्य परत के साथ प्रत्यारोपित पशु की तुलना में बच गया। कोन अस्तित्व की स्थलाकृति, फैल आउट grafted ऊतकों की स्थिति में स्थित उत्परिवर्तित रेटिना की पूरी सतह पर सुरक्षात्मक प्रभाव एक प्रसारण अणु 7 की वजह से है कि इंगित करता है।
अगला, हम सुरक्षात्मक प्रभाव छड़ 8,9 द्वारा एक प्रोटीन का स्राव पर निर्भर करता है कि तथ्य यह मान्य करने के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से वातानुकूलित संस्कृति मीडिया का इस्तेमाल किया। हम इस प्रोटीन Expr किया जाएगा कि परिकल्पनाएक गैर-सेल स्वायत्त तरीके से 10 में छड़ से एक सुरक्षात्मक संकेत के नुकसान से माध्यमिक शंकु अध: पतन ट्रिगर किया जाएगा रोग के पहले चरण के दौरान उनकी मौत की छड़ से और कहा कि लगातार और विशेष रूप से essed। क्योंकि वानरों में शंकु की मध्यस्थता केंद्रीय दृष्टि के महत्व के इस ख्यात प्रोटीन आरपी के लिए एक अत्यधिक प्रासंगिक चिकित्सकीय उपकरण होगा। आरपी में शंकु के संरक्षण सैद्धांतिक रूप से 11 अंधा बनने के लिए दुनिया भर में 15 लाख रोगियों की कुल रोका जा सके। हम एक रेटिना सीडीएनए लाइब्रेरी 12 से रॉड व्युत्पन्न शंकु व्यवहार्यता फैक्टर (RdCVF) एन्कोडिंग एक सीडीएनए की पहचान करने के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण और एक शंकु समृद्ध संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है। RdCVF, दिलचस्प बात यह है redox homeostasis को 13 में शामिल thioredoxin प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग मुताबिक़ जो NXNL1 जीन की spliced उत्पाद है। जीन की दूसरी spliced उत्पाद, RdCVFL अपने लक्ष्य, ऑक्सीडेटिव डी के खिलाफ ताऊ प्रोटीन की रक्षा करता है कि एक एंजाइम है14 amage। RdCVF का प्रशासन शंकु के माध्यमिक अध: पतन और एक पीछे हटने में उनके दृश्य समारोह की हानि, और आरपी 12,15 के प्रमुख मॉडल से बचाता है। यह इस अभिनव चिकित्सकीय रणनीति 16 के दो महत्वपूर्ण पहलुओं को दर्शाता है। सबसे पहले, यह एक जीन-स्वतंत्र ढंग से आरपी अधिकांश मामलों में लागू किया जा सकता है। दूसरा, प्रतिस्पर्धा कारक के विपरीत CNTF, RdCVF अस्तित्व दृश्य समारोह 17 के रखरखाव के साथ जुड़ा हुआ है। कार्यात्मक प्रभाव के अभाव आरपी रोगियों से 18 CNTF के प्रशासन के नैदानिक लाभ के अभाव के कारण समझा जा सकता है। RdCVF इन विट्रो में कोन बचाव RdCVF immunodepletion 12 से हिचकते हैं क्योंकि छड़ और शंकु के बीच महत्वपूर्ण अस्तित्व संकेत में से एक सबसे अधिक संभावना है। इसके अलावा, रॉड व्युत्पन्न कोन व्यवहार्यता जीन के विघटन oxidative तनाव से 19 शिथिलता और संवेदनशीलता फोटोरिसेप्टर की ओर जाता है।
का उपयोगफोटोरिसेप्टर परत RdCVF की पहचान के मूल में और neurodegenerative रोगों 20 में शामिल एक उपन्यास रेडॉक्स संकेत की है। इस पांडुलिपि को अलग करने और फोटोरिसेप्टर परत से संस्कृति कोशिकाओं RdCVF की गतिविधि को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है। फोटोरिसेप्टरों 5 से 7 दिनों में 21 के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इस तकनीक को भी फोटोरिसेप्टर विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
रेटिना जीव विज्ञान में एक मॉडल के अंग है। रेटिना के अध्ययन जीव विज्ञान में 6 प्रमुख खोजों के लिए नेतृत्व किया। यह पहली बार ट्यूमर शमन जीन RB1 के मूल में है। यह sevenless के बेटे के साथ बातचीत के माध्यम से रिसेप्टर tyrosine kinases और एमएपी kinases के बीच आणविक लिंक का पता चलता है। यह Pax6, अंग morphogenesis के लिए पहला मास्टर नियंत्रण जीन की खोज में शामिल किया गया था। यह उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) के साथ पूरक कारक एच (CFH) के आनुवंशिक एसोसिएशन के केंद्र में जीनोम चौड़ा संघ स्क्रीन (GWAS) द्वारा की पहचान की पहली रोग संवेदनशीलता जीन है। अंत में, यह लेबर जन्मजात अंधता के लिए पहली सफल जीन थेरेपी के लिए नेतृत्व किया, किसी का मानव में पहली सुधारात्मक जीन थेरेपी परीक्षण रोग विरासत में मिला है। इस अंग की संरचना सबसे हड्डीवाला प्रजातियों में संरक्षित है। Vivo में हेरफेर के लिए अपनी पहुंच फीसदी के इस अभिन्न अंग पर कार्यात्मक जीनोमिक्स जांच पर जल्दी प्रोत्साहित किया गया हैतंत्रिका तंत्र RAL।
हम vibratome सेक्शनिंग द्वारा रेटिना की भीतरी परत से फोटोरिसेप्टर परत अलग करने के लिए कैसे यहाँ दिखा। यह कदम शुद्ध फोटोरिसेप्टर संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारी विच्छेदन प्रोटोकॉल RPE कोशिकाओं द्वारा संक्रमण बहुत संभावना नहीं बनाता है।
प्रमुख चुनौतियों में से एक अनुभाग ठीक से आंतरिक और बाहरी रेटिना के लिए जरूरी है कि रेटिना के सपाट है। रेटिना के सेक्शनिंग कृन्तकों से उन के रूप में छोटे व्यास के साथ रेटिना पर सबसे अच्छा है और इस व्यास वर्तमान में उपलब्ध सामग्री के साथ तकनीक की एक सीमा है।
यह रेटिना का एक नमूना पर अभ्यास करने के लिए, एक जैविक रूप से सार्थक प्रयोग शुरू करने से पहले सलाह दी जाती है। हम mRNAs और प्रोटीन दोनों की अभिव्यक्ति अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए सामग्री का उपयोग, सुसंस्कृत फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं से प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों के द्वारा विधि वर्णन। अभिव्यक्ति अध्ययनों से यह भी sectio पर वैकल्पिक रूप से किया जा सकता हैएनएस लेजर कब्जा microdissection के द्वारा प्राप्त की है, लेकिन संस्कृतियों सबसे अच्छा vibratome सेक्शनिंग का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं। हम एक पूरी तरह से अलग रणनीति के साथ microdissection के लेजर की तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता था। लेकिन, संस्कृति के लिए microdissection के तंत्र के साथ फोटोरिसेप्टर परत एकत्र करने के लिए, यह लगानेवाला बचने के लिए आवश्यक हो सकता है और यह काफी मौजूदा कार्यप्रणाली मुश्किल होगा।
हम रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा के मॉडल में photoreceptors के अध: पतन के दौरान vibratome वर्गों में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स का अध्ययन करने के उद्देश्य से एक प्रोटोकॉल विकसित कर रहे हैं। हम प्रोटोकॉल का विस्तृत वर्णन रेटिना जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है, और सबसे विशेष रूप से प्रोटिओमिक और metabolomic अध्ययन के लिए होगा कि विश्वास करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |