JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

Published: December 22, 2014
doi:
10.3791/51954
, , , , ,
1Department of Genetics,UMR_S 968, Institut de la Vision, 2Department of Visual Information,UMR_S 968, Institut de la Vision, 3Exploratory Team,UMR_S 968, Institut de la Vision, 4Sorbonne Universités, Paris 06,UMR_S 968, Institut de la Vision, 5INSERM, U968,Institut de la Vision, 6CNRS, UMR_7210,Institut de la Vision

Summary

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Abstract

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית שארגנה ארכיטקטורה, עם נוירונים בשכבות מקולטניות האור, שני מוטות קונוסים במגע עם האפיתל פיגמנט הרשתית בחלק המרוחק ביותר על הרשתית בהתחשב בכיוון של אור, ו תאי הגנגליון במרחק הפרוקסימלי ביותר. ארכיטקטורה זו מאפשרת הבידוד של שכבת קולטי האור על ידי חתך vibratome. הרשתית העצבית גזור של עכבר בגילים 8 ימים היא שטוח משובצת בג'לטין 4% על גבי פרוסה של 20% שכבת photoreceptor ג'לטין פונה כלפי מטה. באמצעות vibratome וסכין גילוח פיפיות, הרשתית הפנימית העבה 100 מיקרומטר מחולקת. חלק זה מכיל את תאי הגנגליון ושכבה הפנימית עם בעיקר תאים דו קוטביים. סעיף מתווך של 15 מיקרומטר הוא מושלך לפני 200 מיקרומטר של הרשתית החיצונית המכילה הקולטניות האור הוא התאושש. ג'לטין הוסר על ידי חימום על 37 מעלות צלזיוס. חתיכות של שכבה חיצונית הן אינקובטוריםטד ב500 μl של הפתרון של רינגר עם 2 יחידות של פפאין הופעל במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס. התגובה הוא נעצר על ידי הוספת 10% בסרום 500 μl עגל עוברי (FCS) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM), ולאחר מכן 25 יחידות של DNAse אני מוסיפה לפני צנטריפוגה ב RT, שטף כמה פעמים כדי להסיר סרום והתאים resuspended ב 500 μl של DMEM וזורע ב1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. התאים גדלים עד 5 ימים במבחנה ויכולת הקיום שלהם הבקיע באמצעות assay חי / מת. טוהר התרבות נקבע תחילה על ידי תצפית מיקרוסקופית במהלך הניסוי. טוהר אומת לאחר מכן על ידי זריעה ותיקון תאים בשקופית היסטולוגית וניתוח באמצעות ארנב polyclonal אנטי-SAG, סמן קולטי אור וחד שבטי עכבר אנטי-RHO, סמן ספציפי קולטי אור מוט. לחלופין, שכבת קולטי האור (מוטות 97%) יכולה לשמש לניתוח ביטוי גנים או חלבונים ולהשתלה.

Introduction

הרשתית היא חלק בלתי נפרד ממערכת העצבים המרכזית שבו יש ארכיטקטורה משומרת בקרב בעלי חוליות. הנוירונים של הרשתית העצבית מאורגנים בשכבות, עם המרוחק ביותר לאור האירוע, שכבת קולטי האור בקשר הדוק עם אפיתל רשתית פיגמנט (RPE) בחלק האחורי של העין. photorecptors רוד והחרוט הם תאים רגישים לאור המסתמכים על מולקולות רגישות opsin עבור לכידת פוטון. מולקולות אלה סגורות על קרומי דיסק של מבנה תאי, הממוקמים בקטע החיצוני של קולטי האור המצביע בכיוון של הרשתית 1. מבנה זה, שלרוב מושפע בשלב מוקדם מאוד במקרים של מחלות קולטי אור, מתחדש בשיעור של 10% בכל יום. השכבה הפנימית שנקראו מכילה את רוב תאי העצב האחרים שלחשב את עוצמת האות הנקלטת מהקולטניים האור, דו-קוטבי, וamacrine תאים אופקיים, כמו גם את תאי גנגליון. אלה אחרון עם האקסונים שלהםיוצר קרן שהוא עצב הראייה. שכבות זה כל כך שמורה שהביולוגים השתמשו תאי amacrine הטווח נעקר כאשר התאים נמצאים מחוץ לשכבה הפנימית plexiform 2. שכבות של תאי עצב מופצות בתוך שריון של תאי גליה רדיאלי מולר. תאים דו קוטביים לקשר קולטניים אור לתאי גנגליון. הם נמצאים בין שכבת plexiform החיצונית והשכבה הפנימית plexiform. תאי הגנגליון יוצרים שכבת plexiform הפנימית בקשר עם התאים דו קוטביים. תאי amacrin נקראים כמו תאי עמותה ממוקמים בשכבת plexiform הפנימית בין התאים דו קוטביים ותאי הגנגליון. השכבה החיצונית plexiform מכילה תאים אופקיים. הסדר ייחודי זה של שכבות עצביות של מערכת העצבים המרכזית מאפשר הבידוד של שכבת קולטי האור משיכבת התאים הפנימית על ידי חיתוך הרשתית רכוב שטוחה באמצעות vibratome.

במקור, טכניקה זו שימשה לבודד את קולטני האור לטראןsplantation בעיניים של עכבר RD1, מודל של רטיניטיס פיגמנטוזה האנושי (RP) 3. עכבר RD1 נושא מוטציה רצסיבית בגן Pde6b אשר מקודד למקטע בטא phosphodiesterase המוט ספציפי. מוטציות רצסיבי של הגן הזה בתוצאת RP בבני האדם 4. לאחר קולטני אור מוט התנוונו, החולה מאבד את ראיית הלילה, וקולטני אור חרוט באופן מפתיע, שאינו מבטא את הגן שעבר מוטציה, מנוון כצעד שני. בגלל קונוסים נדרשים לראיית צבעים וחדות ראייה, החולים הופכים בהדרגה עיוורת וטיפול יעיל למחלה עדיין לא פיתח. על ידי השתלת שכבת קולטי אור מעכבר wild-type הניוון החרוט של עכבר המארח מתעכב 3.5. המוטות איבדו במודל ניוונית מוט חרוט לא יכולות להיות מוחלפות על ידי השתלה כי ניתן להשיג את הקשר הסינפטי בין מוטות ותאים דו קוטביים רק בשלב מסוים של rפיתוח etinal, שסומן על ידי ההופעה של ביטוי NRL 6. השכבה של קולטני אור מוצגת על ידי ניתוח בחלל תת-רשתית של רשתית RD1 המוט פחות, בין הרשתית והרשתית החיצונית המתאימה רק 3% מקולטניים האור שנותר, את הקונוסים. שבועיים לאחר הניתוח, 40% מהאצטרובלים מבעלי החיים מושתלים בשכבת photoreceptor נורמלית שרדו בהשוואה לבעלי החיים מושתלים בשכבה רגילה של תאים ברשתית פנימיים, או לבעלי חי הדמה המופעל. הטופוגרפיה של הישרדות קונוס, פרוש מעל פני השטח של רשתית מוטציה הממוקמת במיקום של הרקמה מורכב מציינת כי ההשפעה המגנה היא בשל מולקולת diffusible 7.

בשלב הבא, היינו מערכת שיתוף תרבות, כמו גם תקשורת ותרבות המותנה כדי לאמת את העובדה שההשפעה המגנה מסתמכת על הפרשת חלבון על ידי מוטות 8,9. אנו משערים כי חלבון זה יהיה Expressed ברציפות ובאופן ספציפי על ידי מוטות ושמותם במהלך השלב הראשון של המחלה תפעיל ניוון חרוט משניים מאובדן אות מגן ממוטות באופן אוטונומי שאינו תא 10. בשל החשיבות של ראייה מרכזית חרוט בתיווך בפרימטים חלבון משוער זה יהיה כלי טיפולי רלוונטי ביותר עבור RP. שמירה על קונוסים בRP היה תיאורטית למנוע כוללת של 1.5 מיליון מטופלים ברחבי העולם על מנת להפוך לעיוור 11. יש לנו להשתמש בגישת תכולה גבוהה הקרנה ומודל תרבות מועשרת קונוס לזהות cDNA קידוד Cone נגזר רוד הכדאיות פקטור (RdCVF) מספריית cDNA רשתית 12. RdCVF הוא מוצר שחבור של גן NXNL1 ש, מעניין הוא הומולוגי לגן המקודד לחלבוני thioredoxin המעורב בהומאוסטזיס חיזור 13. מוצר שחבור השני של הגן, RdCVFL הוא אנזים המגן על היעד שלה, חלבון אוניברסיטת תל אביב נגד ד חמצוניamage 14. מנהל של RdCVF מונע ניוון המשני של קונוסים ואובדן תפקוד הראייה שלהם ברצסיבית, ומודל דומיננטי של RP 12,15. זה מדגים שני היבטים חשובים של אסטרטגיה טיפולית חדשנית זה 16. ראשית, זה יכול להיות מיושם ברוב המקרים RP באופן גן-עצמאי. שנית, הישרדות CNTF, RdCVF בניגוד לגורם המתחרה קשורה לשמירה על תפקוד הראייה 17. היעדר ההשפעה תפקודית עשוי להסביר את הסיבה של היעדר התועלת קלינית של המינהל בCNTF לחולי RP 18. RdCVF הוא הסיכוי הטוב ביותר אחד של אות ההישרדות החשובה בין מוטות קונוסים מאז ההצלה החרוט במבחנה היא מעוכבת על ידי immunodepletion RdCVF 12. בנוסף, השיבוש של גן הכדאיות חרוטה נגזר המוט מוביל לחוסר תפקוד וקולטי אור רגישות ללחץ חמצוני 19.

השימוש בשכבת קולטי אור היא במקור של הזדהות של RdCVF ושל אות חיזור רומן מעורבת במחלות ניווניות 20. כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המשמש לבודד תאים ותרבות משיכבת photoreceptor לאפיין את הפעילות של RdCVF. יכול להישמר הקולטניים האור בתרבות במשך 5 עד 7 ימים 21. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הביטוי של גנים ספציפיים קולטי אור.

Protocol

הערה: הנוהל אושר על ידי ועדת האתיקה דרווין מפירית ומארי קירי אוניברסיטה (Ce5 / 2009/048) 1. הכנת לטין פתרון, מכשירים, Vibratome, תרבות מדיה ותרבות צלחת הכן פתרון ג'לטין 20% לפחות יום אחד לפני הניסוי. מתחת למכסה המנוע, להוסיף 500 μl של gentamycin [10 מ"ג / מיליליטר] לבקבוק 500 מיליליטר המכיל CO 2 בינוניים עצמאי (CO 2 -i). בכוס נפרדת, להוסיף 20 מיליליטר של CO2-I (מצעד 1.1.1) וחום על 95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום עם ערבוב מתמיד במשך 15 דקות. תבחין בשינוי צבע לצהוב, מצביע על כך שהפתרון מוכן לשימוש נוסף. לשקול 4 גרם של ג'לטין ועני בהדרגה לפתרון מוכן לעיל (שלב 1.1.2) עם ערבוב וחימום מוגבר על 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות, כדי להשיג פתרון צבע צהוב. אפשר פתרון ג'לטין כדי לקרר תחתלמכסה המנוע לכ 5 דקות. יוצקים 4 מיליליטר של פתרון ג'לטין לתרבות מנות קוטר 35 מ"מ ללא החדרת בועות אוויר. שמור את הצלחת על 21 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. מכסה את המנות עם סרט פלסטיק, ולהפוך את המנות. לחלופין, לאחסן את הכלים על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים לפני השימוש. הכן פתרון ג'לטין 4%. מתחת למכסה המנוע, להוסיף 25 מיליליטר של CO 2 בינוני -i במכל פלסטיק סטרילי, וחום על 42 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. הוצא את המדיה מבלוק החימום ולהוסיף 1 גרם של ג'לטין בהדרגה למדיום החם ומערבבים. במהירות להחזיר את המכל על בלוק החימום (42 מעלות צלזיוס) ולשמור אותו חם בתהליך. הקמה של המנגנונים vibratome: הסר את המנות המכילות 20% פתרון ג'לטין מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. חותך את הג'לטין עם אזמל. הפוך את פרוסת ג'לטין ולתקוע אותו על דיסק התמיכה השחור של vibratome באמצעות טיפה שלדבק uper. לשבור סכין גילוח לשני חצאים, והכנס את מחצית לשקע vibratome מחזיק. הכנס את דיסק תמיכה השחור על מנגנון vibratome. הפעל את הידית השחורה לצד ימין. תקן את הקיבול מחזיק על ראשו של vibratome. להוסיף כמות מספקת של CO 2 בינוני -i במכל vibratome כדי לכסות את גוש הג'לטין. הפעל את vibratome ולחתוך שלוש 100 מיקרומטר פרוסות של גוש ג'לטין. שמור את גוש הג'לטין לשימוש נוסף. הכן 40 מיליליטר של מדיום תרבות: הכן בינוני השתנה Dulbecco נשר (DMEM) עם 10% של עגל בסרום עוברי (FCS) מתחת למכסת המנוע. הכן 1 מ"ג מלח חיץ פוספט באמצעות מיליליטר Poly-D- ליזין pH / (PBS) 7.4. בצלחת 96-היטב, להוסיף 2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר של פולי-D-ליזין למעייל התחתון של הבארות. דגירה את הצלחת למשך 45 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. לאחר דגירה, להסיר את PBS ולהחליף עם 200 μl/ גם DMEM ומקום שוב על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור לפני השימוש. 2. Dissection של רשתית שלמה Enucleate העכבר: להקריב את העכבר על פי ההנחיה האירופית 2010/63: נקע בצוואר רחם. חותך את הראש עם מעוקלים-מספריים ולמקם אותו בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ לאחר שחטא את העין עם חומר חיטוי. הסר את העין לאחר שניתק את עצב הראייה על ידי חתך אותו באמצעות אחיזה מעוקלת מאוד בזהירות. אז למקם את שני העיניים בצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה בינוני -i סטרילי CO 2 ב 21 ° C. הסרת הרשתית: לעשות חור ברמה של העין-האיבר בעזרת מחט 18 G כדי להיות מסוגל להציג את המספריים לגלובוס עין. להציג את המספריים ישר בתוך החור ולחתוך בזהירות בלובן העין מתחת לאיריס על כל המערכת של הגלובוס העיני כדי להסיר גוף הריסים. <li> הסר את הקרנית והעדשה ולשמור על התא האחורי של העין עם רציף הרשתית ללובן העין. עם שתי נקודות אחיזה בסדר, להסיר את הזגוגית ממוקמת בתוך החדר האחורי ללא פגיעה ברשתית. לבצע ארבעה חתכים רדיאליים (רשתית / לובן העין) להתיר השטחה של הרשתית. עליית הגלובוס העיני ולקלף אותו כמו "תפוז". לנתק את הרשתית מלובן העין ואפיתל רשתית פיגמנט (RPE). לנתק את הרשתית עדיין מחוברת ברמה של עצב הראייה בזהירות עם מעוקלים-מספריים עדינים. לנתק את הזגוגית שנותרה מהפריפריה לכיוון המרכז של הרשתית עם שתי נקודות אחיזה בסדר. ודא שכל הזגוגית נמחקה לחלוטין על מנת לאפשר להשטחה של הרשתית. חותך את הקצה של פיפטה פלסטיק ולהעביר את הרשתית לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה CO 2 בינוני -i עם פיפטה הפלסטיק. 3. איטום של שטוח mounteד רשתית על טין בלוק הסר 20 – 30 מיליליטר של CO 2 בינוני -i מטנק vibratome (גוש ג'לטין ללא תשלום), כדי לאפשר האיטום של רשתית רכוב שטוחה. העבר את הרשתית לשקופיות זכוכית בעזרת פיפטה פלסטיק ולהוסיף טיפה של CO 2 בינוני -i לפני העברה לפרוסת ג'לטין עם קולטי האור פונים כלפי מטה על פרוסת ג'לטין. צרף את הרשתית לבלוק ג'לטין בעדינות על ידי הזרקת ג'לטין 4% חימם בצד אחד של הבלוק בין הרשתית וגוש ג'לטין ובו זמנית גירוש ג'לטין החם בצד השני. ג'לטין 4% לשאוב עם פיפטה פסטר. חכה 10 דקות כדי לאפשר איטום מוחלט. להוסיף CO 2 בינוני -i לטבול את הגוש ואת הלהב לחלוטין. 4. חתך הרשתית הערה: שלב זה הוא קריטי להשגת שכבה של תאי קולטי אור ללא תאי רשתית אחרים (איור 1). החל מהחלק העליון בשכונה ג 'לטין, לחתוך 100 מיקרומטר סעיפי סדרתי להגיע לרשתית. ואז לחתוך 100 – של השכבה הפנימית 120 מיקרומטר סעיפים. בהתאם ליישום, שכבה זו עשויה להיות מושלכת או מאוחסנת בחנקן נוזלי. ודא שהמהירות של vibratome היא מאוד איטית (1 או 2) בחתך של שכבות שכבה או קולטניות אור הפנימית. בצע 15 מיקרומטר חלקי ביניים של הרשתית המתאימה לממשק שבין הפנימי והחיצונית של הרשתית. שים לב סעיף זה תחת מיקרוסקופ. היעדרם של כלי דם מצביע על כך שכבר הגיעה לרשתית החיצונית. חותך 200 מיקרומטר של הרשתית החיצונית (שכבת קולטי האור) עם ג'לטין ולהעביר אותו לצלחת בקוטר 35 מ"מ מלא 3 מיליליטר של CO 2 בינוני -i. שמור את זה על קרח עד שכל חלקי שכבת קולטי אור של כל הרשתית מתקבלים. 5. תאי קולטי אור מתנער קח את הצלחת (es) המכיל את שכבת קולטי האור (ים) והכנסתי אותו (אותם) בחממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שימוש במלקחיים בעדינות להפריד את שכבת קולטי האור מג'לטין ולהעביר אותו בצלחת חדשה מלאה עם 3 מיליליטר של תמיסת רינגר. חזור על שלב זה (5.2) עבור כל הכנת שכבת קולטי אור. דגירה 2 יחידות של פפאין עם 25 μl של פתרון activator (1.1 mM EDTA; L-cystein 5.5 מ"מ; β-mercaptoethanol 60 מיקרומטר) בצינור סטרילי פוליפרופילן 5 מיליליטר ו דגירה זה 30 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור . ההפעלה של פפאין מושגת על 37 מעלות צלזיוס. במהלך דגירה זה, לחתוך את שכבת קולטי האור לתוך 2 מ"מ 2 חתיכות (לא קטנות מדי) ולהעביר את החלקים הללו לתוך 5 מיליליטר צינורות. יש לשטוף את הרשתית פעמיים עם 1.5 מיליליטר של התמיסה של הפתרון Ringer אחרי שקיעה הכבידה. הסר את כל הפתרון של רינגר שנותר מהצינור עם הדגימה. להוסיף 475 μl של הפתרון של רינגר לצינור המכיל פפאין ותמהיל הופעל. להוסיף את הפתרון הזה לצינור המכיל את הרשתית. דגירה הצינור עם הרשתית במשך 20 דקות ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. לעצור את התגובה על ידי הוספת 1 מיליליטר של 10% FCS בDMEM. הוסף 25 U של deoxyribonuclease אני (DNAse I) ל- DNA מתעכל מתאי מוות. homogenize בזהירות את ההשעיה התא באמצעות 1 מ"ל פיפטה. ספין ב 50 XG במשך 6 דקות ב RT. בטל supernatant כדי להסיר עקבות של סרום ולהוסיף DMEM בינוני עם תוספים (ראה טבלה של reagents_equipment הספציפי) לתא-גלולה וresuspend בזהירות את ההשעיה התא עם טפטפת מיליליטר 1. ספין ב 50 XG במשך 6 דקות ב RT. חזור על שלב זה (5.7) פעם נוספת. 6 תאי קולטי אור Culturing שכבת קולטי האור של עכבר בPN8 מכילה כ 1-1,500,000 תאים באמצעות טכניקה זו. זרעי תאי קולטי האור ליום 1 בx 10 5 תאים / 2 סנטימטר בצלחת תרבות עם מדיום תרבות ותרבות התאים במשך 5 ימים ב 37 ° C בתוך 5% CO 2 באינקובטור. ביום 5, המשך immunochemistry ושיטות מחקר הבא מערביות סופג מסופקות על ידי ספקי הנוגדן. הערה: צעדים כדי לעצור את התרבות ובדיקות ראשוניות מתוארות בהתייחסות 21.

Representative Results

מלבד השתלה, שכבות קולטי האור גם נעשתה שימוש כדי ללמוד איתות תא על ידי זריעת תאי קולטי אור להכנת תרבויות 12,22. בנוסף, הם משמשים ללמוד ביטוי גנים ו23,24 קצב היממה. יש לנו להשתמש שכבת photoreceptor התא מעכבר wild-type ביום שלאחר הלידה 8 להכין תרבויות קולטי אור בהעדר FCS ומתוחזק התאים במשך 5 ימים ב 37 ° C באינקובטור עם 5% CO 2 (איור 1E ). התאים אז היו קבועים באמצעות paraformadehyde 4% ולאחר מכן המשיכו לניתוח immunocytochemical תוך שימוש בשיטות הניתנות על ידי ספקי הנוגדן חד שבטי או עם עכבר אנטי-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) או ארנב polyclonal אנטי-SAG (1: 200, נדיב מתנה של יגאל גרי ודוד היקס). אנחנו השתמשנו אנטי-RHO ואנטי-SAG (אם כי קונוסים אנטי-SAG תווית ומוטות) בשל העובדה שאנטי SAG הוא סמן מוקדם יותר, מאשר אנטי-RHO. חלקם של cells החיובי לנוגדנים נגד RHO הוא נמוך יותר מאלה חיוביים לנוגדנים אנטי-SAG (איור 2). זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שSAG, arrestin המוט בא לידי ביטוי גם על ידי קונוסים ההופכים 3% מקולטניים אור בשכבה המבודדת, או לחלופין על ידי העובדה כי במהלך ההתבגרות שלאחר לידה של הרשתית, הביטוי של SAG הקודם ש של RHO 25,26. שכבת קולטי האור שימשה גם כדי לפקח על הביטוי הספציפי של גנים על ידי קולטני אור ברשתית wild-type והמוח של בעלי חיים בגילים 35 ימים RNA הוכן באמצעות ultracentrifugation CsCl 27 והכלאה למערך שבבי DNA עכבר. השליחים לרודופסין (Rho), S-arrestin (סאג) וקונוס-transducin (Gnat2) באים לידי ביטוי באופן ספציפי ברשתית בהשוואה למוח (איור 3 א). הביטוי בולט בשכבת קולטי האור (PR) מאשר בכל הרשתית הכוללתשכבת הרשתית הפנימית מראה כי גנים אלה באים לידי ביטוי על ידי קולטניים אור אכן. לGnat2, הביטוי היחסי בהשוואה לRho וסאג מראה שהוא בא לידי ביטוי על ידי קונוסים הכילו בתוך השכבה המבודדת קולטי האור. הביטוי של recoverin (Rcvrn) בשכבת קולטי האור בהשוואה לכל הרשתית הוא גדל (איור 3). שכבת קולטי האור שימשה גם כדי לפקח על הביטוי של RHO וGNAT2 באמצעות מערבי סופג הבאים שיטות הניתנות על ידי ספקי הנוגדן ולהשוות לשכבה הפנימית של הרשתית (איור 4). שים לב להעדרו של RHO וGNAT2 28, הסמנים של מוטות קונוסים בהתאמה בכל הרשתית וברשתית של עכבר RD1 ביום שלאחר הלידה 35. Fiתרשים 1. מבט סכמטי של חתך vibratome של רשתית עכבר. סעיף (א) התקנה של הרשתית רכוב שטוחה עם קולטי האור פונים כלפי מטה על פרוסת ג'לטין. (B) של הרשתית הפנימית עם להב vibratome. סעיף (C) של הרשתית החיצונית נוסף של ג'לטין. (ד) פיקוח על הנוכחות של קולטי אור בקצה הקטע של רשתית לאחר הבידוד של שכבת קולטי אור. בר סולם המשמש לקרינה ירוקה משמש של מיקרוסקופ אור לבנה. קולטני האור ממוקם בקצה של התמונה. (E) בתרבית תאי קולטי אור (לאחר חמישה ימים). הגדלה גבוהה של הפנל E. (F) איור 2. ביטוי דיפרנציאלי של RHO וSAG בתרבות קולטי אור עכבר. (א) מכתים של גרעינים (כחול), (צביעת SAG (ירוק B)), (צביעת RHO (אדום C)). (ד) מוזגה תמונה. משום ההכתמה של SAG באה לידי ביטוי מוקדם יותר מהכתמת RHO, רק שני תאים כפולים שכותרתו SAG וRHO (ראה *). בר סולם:. 23 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. השוואה של הביטוי של שלושה גנים במוח ורשתית כל וקולטני אור של החיות בר-הסוג בגילים שלושים וחמישה ימים. () Rhodopsin (Rho), S-arrestin (סאג) וקונוס-transducin (Gnat2). (ב) Calbindin (Calb1) וRecoverin (Rcvrn). הנתונים מוצגים כביטוי יחסי. הביטוי היחסי הוא ערך ביטויהמתקבל מנתוני microarray לאחר normaliszation עם התוכנה חזקה Multi-המערך הממוצע (RMA) זמין באתר הידע KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). איור 4. ביטוי של RHO וGNAT2 ברשתית חיצונית מרשתית wild-type ביום 35. היעדרות לאחר לידה הביטוי שלהם ברשתית הפנימית וברשתית של עכבר RD1 ביום שלאחר הלידה 35. ACTB, בטא -actin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <!– Repeat of the materials table שם חומר / ציוד חברה מספר קטלוגי תגובות / תיאור Cytidine 5'-diphosphocholin * סיגמא אולדריץ C0256 4.7 מיקרומטר Cytidine 5'-diphosphocholin Cytidine 5'-diphosphoethanolamine * סיגמא אולדריץ C0456 2.7 מיקרומטר Cytidine 5'-diphosphoethanolamine אלבומין חומצה / סרום שור לינולאית (BSA) * סיגמא אולדריץ L8384 100 מיקרוגרם / מיליליטר לינולאית אלבומין חומצה / סרום שור (BSA) Triiodo-L-thyronine * סיגמא אולדריץ T6397 0.03 מיקרומטר Triiodo-L-thyronine צלחת 96-בארות גריינר ביו-אחד 655-095 מיקרוסקופ דו-עינית לייקה MZ-75 CO 2 עצמאי (CO 2 i) החיים Technologies 18045054 DMEM Life Technologies 41966029 מלקחיים n ° 5 דומון בִּיוֹנִי 11,254-20 ג'לטין מסוג עור porcin סיגמא אולדריץ G2500 GeneChip Affymetrix U74v2 פתרון גנטמיצין Life Technologies 15710049 Hydrocortison * סיגמא אולדריץ H0888 0.55 מיקרומטר hydrocortison * אינסולין (I) סיגמא אולדריץ I1884 (ITS) 0.86 מיקרומטר אינסולין (I) פפאין וורטינגטון-Biochem WOLS03124 פולי-D-ליזין סיגמא אולדריץ P-6407 פרוגסטרון * סיגמא אולדריץ P7556 2.0 מיקרומטר פרוגסטרון פרוסטגלנדין * סיגמא אולדריץ P5172 0.28 מיקרומטר פרוסטגלנדין פוטרסין * סיגמא אולדריץ P5780 פוטרסין 182 מיקרומטר האזמל אלביון EMS 72000 מספריים מוריה 15,396-00 נתרן פירובט * סיגמא אולדריץ S8636 פירובט נתרן 1 מ"מ * סלניט נתרן (S) סיגמא אולדריץ I1884 (ITS) 0.29 מיקרומטר Na 2 SEO 3 (S) טאורין * סיגמא אולדריץ T8691 3 טאורין מ"מ <td> * Transferrin (T) סיגמא אולדריץ I1884 (ITS) 0.07 מיקרומטר transferrin (T) מנגנון Vibratome לייקה VT1000-S * תוספי טבלת 1: חומר ספציפי וציוד של שימוש. ->

Discussion

הרשתית היא איבר מודל בביולוגיה. מחקר של הרשתית הוביל ל6 תגליות גדולות בביולוגיה. זה במוצא של RB1 הגן מדכא הגידולים הראשונים. הוא מגלה את הקשר בין מולקולרי טירוזין קינאז קולט וקינאז MAP דרך האינטראקציה עם בן sevenless. זה היה מעורב בגילוי Pax6, גן הבקרה הראשית הראשון להמורפוגנזה איבר. זה במרכז הקשר הגנטי של גורם משלים H (דנ"א) עם ניוון מקולרים הקשור לגיל (AMD), גן רגישות המחלה הראשון שזוהה על ידי מסך התאגדות רחבה הגנום (GWAS). לבסוף, היא הובילה לריפוי גן המוצלח הראשון לamaurosis המולדת לבר, משפט הריפוי גנטי המתקנת הראשון בבני של כל מחלה תורשתית. המבנה של איבר זה נשמר ברוב המינים של בעלי חוליות. נגישותו למניפולצית in vivo עודדה מוקדם על חקירות גנומיקה פונקציונליות בחלק נפרד של הסנטRAL מערכת עצבים.

אנחנו מראים כאן איך להפריד את שכבת קולטי האור מהשכבה הפנימית של הרשתית על ידי חתך vibratome. שלב זה הוא קריטי להשגת תרבויות קולטי אור טהורות. הפרוטוקול לנתיחה שלנו הופך את הזיהום על ידי תאי RPE מאוד לא סביר.

אחד האתגרים הגדולים הוא השטחה של הרשתית שיש צורך הסעיף כראוי הפנימי והחיצונית של הרשתית. חתך של הרשתית הוא הטוב ביותר ברשתית עם קוטר קטן כמו אלה ממכרסמים וקוטר זה הוא מגבלה של הטכניקה עם חומר זמין נוכחי.

מומלץ לפני תחילת ניסוי משמעות ביולוגית, להתאמן על מדגם של הרשתית. אנו מדגימים את השיטה על ידי נציגי תוצאות המתקבלות מתאי קולטי אור בתרבית, באמצעות החומר לבצע מחקר ביטוי של שני mRNAs וחלבונים. ניתן גם לבצע מחקרי ביטוי לחלופין על sections מתקבל על ידי microdissection ללכוד לייזר, אבל התרבויות מבוצעות הטובות ביותר באמצעות חתך vibratome. היינו יכול להשתמש בטכניקה של לייזר microdissection עם אסטרטגיה שונה מלאה. אבל, כדי לאסוף את שכבת photoreceptor עם מנגנון microdissection לתרבות, זה יהיה נחוץ כדי למנוע מקבע וזה יסבך את המתודולוגיה הנוכחית באופן משמעותי.

אנחנו מפתחים פרוטוקול שנועד לומד קינטיקה של גן וביטוי חלבון בסעיפי vibratome בניוון של קולטני אור במודלים של רטיניטיס פיגמנטוזה. אנו מאמינים כי התיאור מפורט של הפרוטוקול יהיה שימושי לחוקרים בתחום הביולוגיה ברשתית, ובעיקר ללימודים proteomic וmetabolomic.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

Materials

Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cytidine 5′-diphosphocholin* Sigma-Aldrich C0256 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* Sigma-Aldrich C0456 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* Sigma-Aldrich L8384 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)
Triiodo-L-thyronine* Sigma-Aldrich T6397 0.03 µM Triiodo-L-thyronine
96-wells plate Greiner bio-one 655-095
Binocular microscope Leica MZ-75
CO2 independent (CO2-i) Life Technologies 18045054
DMEM Life Technologies 41966029
Forceps n°5 Dumont Bionic 11254-20
Gelatin from porcin skin type A Sigma-Aldrich G2500
GeneChip  Affymetrix U74v2
Gentamicin solution Life Technologies 15710049
Hydrocortison* Sigma-Aldrich H0888 0.55 µM hydrocortison
Insulin* (I) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.86 µM insulin (I)
Papain Worthington-biochem WOLS03124
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-6407
Progesterone* Sigma-Aldrich P7556  2.0 µM progesterone
Prostaglandin* Sigma-Aldrich P5172 0.28 µM prostaglandin
Putrescine* Sigma-Aldrich P5780  182 µM putrescine
Scalpel Albion EMS 72000
Scissor  Moria 15396-00
Sodium Pyruvate* Sigma-Aldrich S8636 1 mM sodium pyruvate
Sodium Selenite* (S) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.29 µM Na2SeO3   (S)
Taurine* Sigma-Aldrich T8691 3 mM taurine
Transferrin* (T) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.07 µM transferrin (T)
Vibratome apparatus Leica VT1000-S
* Supplements
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. , (2014).
  2. Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
  3. Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
  4. . RetNet, the Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014)
  5. Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
  6. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
  7. Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
  8. Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
  9. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
  10. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
  11. Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
  12. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
  13. Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules–from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
  14. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  15. Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
  16. Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).
  17. Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
  18. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
  19. Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
  20. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).
  21. Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
  22. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  23. Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
  24. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  25. Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
  26. Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
  27. Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
  28. Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).

Tags

VibratomeRetinaPhotoreceptorCultureMouseGelatinCentrifugationPapainDNAseDMEMFCSSAGRHORodCone

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Clérin, E., Yang, Y., Forster, V., Fontaine, V., Sahel, J., Léveillard, T. Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures. J. Vis. Exp. (94), e51954, doi:10.3791/51954 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image