التفكك الحاد من الجلكى الشبكي المحاوير لتمكين تسجيل من الإصدار الوجه غشاء من محطات قبل المشبكي الوظيفية الفردية

انتقال متشابك هو عملية سريعة ودقيقة للغاية. العمل غزو محتمل من المحطة قبل المشبكي يؤدي إلى فتح VGCCs تقع في الغشاء الإفراج جهه، والزيادة الناتجة في كاليفورنيا قبل المشبكي ²⁺ بوصفها الزناد عن الانصهار الحويصلة والعصبي الإفراج ^1. كل هذه الخطوات تحدث داخل مئات ميكروثانية ^2، وبالتالي تتطلب اقتران مكاني ضيق من VGCCs إلى حويصلة الانصهار الآلات ^3. وقد تميزت الكالسيوم قبل المشبكي ²⁺ تدفقات المقام الأول من خلال النهج التصوير باستخدام الأصباغ الكالسيوم ²⁺ الحساسة ^4. دمج الكالسيوم ²⁺ المخازن المؤقتة التي تعدل الكالسيوم في الخلايا العصبية قبل المشبكي ²⁺ وقد استخدم لتوصيف غير مباشر العلاقة بين الكالسيوم والنقل العصبي قبل المشبكي ^3. بالإضافة إلى ذلك، تحوير قبل المشبكي مجانا كا ²⁺ تركيز الكالسيوم عن طريق uncaging ^{2+ 5} أو تسجيل macroscopiج كا استخدمت ²⁺ التيارات جنبا إلى جنب مع التدابير الانصهار الحويصلة و / أو الإطلاق. مثل قياسات السعة ^{2 6} أو بعد المشبكي الردود على معالجة نفس السؤال. ومع ذلك، تميز كا ²⁺ التيارات مباشرة في وجه الإفراج عنهم، وقسم متخصص للغشاء قبل المشبكي حيث تتم ترجمة الاستقطاب في غشاء الكالسيوم ²⁺ التيارات اثار الانصهار حويصلة متشابك وإطلاق ناقل عصبي، هو جزء لا يتجزأ من الحصول على قياس دقيق لكا ²⁺ شرط حويصلة متشابك الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تميز مباشرة الكالسيوم ²⁺ التيارات في محطات قبل المشبكي فردية، إلى جانب قياسات دقيقة في وقت واحد الانصهار حويصلة والافراج يسمح التوضيح الدقيق للعلاقة بين توقيت مدار الساعة من إمكانات العمل، قبل المشبكي الكالسيوم ²⁺ الحالية، الانصهار حويصلة والافراج عنهم. الوصول إلى غشاء الإفراج الوجهغير متوفرة في معظم محطات قبل المشبكي المقرر ان تغلق بدل من التشعبات بعد المشبكي. وكانت هذه صعوبة الوصول عقبة رئيسية في توصيف VGCCs لأنه يمنع القياسات المباشرة الحالية في محطات قبل المشبكي فردية. وحتى الآن لم توصيف المباشر من قبل المشبكي الكالسيوم ²⁺ التيارات في محطات قبل المشبكي فردية ممكن في نقاط الاشتباك العصبي المركزي، وقد تتحقق إلا في اثنين من نوع كأسي محطات قبل المشبكي. الكأس من نوع المشبك من فرخ العقدة الهدبية ^7-10 والفئران الكؤوس ^11،12. في جميع محطات قبل المشبكي الأخرى بما في ذلك المشبك الشبكي العملاق في الجلكى الحبل الشوكي ^13، وعدم الوصول إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج الوجه وقد استلزم استخدام الأساليب غير المباشرة مثل التصوير الكالسيوم ²⁺ لدراسة الكالسيوم قبل المشبكي ²⁺ التدفقات.

<img alt="الشكل 1" fس: محتوى العرض = "5in" SRC = "/ الملفات / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" العرض = "500" />
الرقم 1. الجلكى المشبك الشبكي العملاق. (أ) عبر قسم من الجلكى الحبل الشوكي مما يدل توجيه ظهراني البطني. وتتميز محاور الشبكي مع أستريكس الأخضر (ب) إعادة الإعمار 3-D من المشبك الشبكي في النخاع الشوكي الجلكى تظهر المحوار قبل المشبكي الشبكي جعل العديد أون الاتصالات بسنت (تميزت السهام الخضراء) على عصبون بعد المشبكي ^13. وقد وصفت محطات قبل المشبكي مع اليكسا فلور 488 هيدرازيد phalloidin مترافق (الأخضر)، بينما يتم شغل عصبون بعد المشبكي مع اليكسا فلور 568 هيدرازيد (الحمراء).

محاور الشبكي الجلكى العملاقة، وتقع في المنطقة البطنية من النخاع الشوكي مواز للمحور منقاري الذيلية-1A الشكل، شكل متعددة أون الاتصالات متشابك بسنت على الخلايا العصبية للالشوكي القرن البطني الشكل 1B ^{14 13.} وقد سجلت العيانية خلية كاملة الكالسيوم ²⁺ التيارات من محاور الشبكي في النخاع الشوكي سليمة ^13،15. ومع ذلك، محاولات عمياء السابقة في القياس المباشر من الكالسيوم أثبتت ²⁺ التيارات في محاور الشبكي في الجلكى الحبل الشوكي سليمة باستخدام الخلية المرفقة تقنية المشبك التصحيح الفاشل ¹³ بسبب عدم وجود الوصول إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج الوجه بسبب العمليات بعد المشبكي معارضة الشكل 1B. غشاء الإفراج وجه أحرز في السابق الوصول إليها عن طريق إزالة الخلايا العصبية بعد المشبكي ^11، اضطراب الميكانيكية المشبك قبل تسجيل ¹² أو المعالجة الأنزيمية إلى جانب التفكك الميكانيكية ^16. نظرا لمنظمة معقدة من الحبل الشوكي، فإنه يكون من الصعب للغاية تحديد الخلايا العصبية بعد المشبكي وسحب ذلك ميكانيكيا أو التشويش عشرالبريد المشبك. ومن هنا، قررنا استخدام المعالجة الأنزيمية ¹⁷ تليها التفكك الميكانيكية.

باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير وإعداد فصلها تماما من الحبل الشوكي الجلكى أن ينتج محاور الشبكي منعزلة قابلة للحياة مع محطات قبل المشبكي وظيفية خالية من أي عمليات بعد المشبكي، وبالتالي توفير وصول غير مقيد إلى محطات قبل المشبكي الفردية. بالتزامن مع معيار مقلوب المجهر والتصوير مضان، وتمكننا من تحديد واستهداف محطات قبل المشبكي fluorescently التي تم تحديدها الفردية، مع ماصة التصحيح يحتوي على محلول التسجيل الذي يعزل الكالسيوم ²⁺ التيارات والشكل الشكل 4C 4D، لتسجيل باستخدام الخلوي تعلق تقنية الجهد المشبك. وقد سجلت كاليفورنيا ²⁺ التيارات مباشرة في الغشاء قبل المشبكي الإفراج مواجهة فردية محطات قبل المشبكي الشكل 4F. هذا هو الهامة فياختراق الإقليم الشمالي في مجال انتقال متشابك لأنه هو الأول من نوعه التسجيل التي يتعين الاضطلاع بها في نقاط الاشتباك العصبي المركزي.