C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans
Summary
Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.
Abstract
Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 'lik bir konsantrasyon – sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.
Introduction
Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim 1 itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre 2 içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun oldu, 5, 4, 3 6, 7 nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır.
Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış – 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C'de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur.
Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana kimyasal olarak 9, 10 8, 2 karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde 9, bir ham özü Dauer feromon 11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu. </p>
Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu 12, 13, 14 sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer 13, 14 sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson 12 biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan 4, 8, 15, 16, 17, 18 tarif edilen ve derlenmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.
Materials
| N2 C. elegans Bristol strain | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | Upon request from Schroeder lab | ||
| PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V | Upon request from Schroeder lab | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri dishes | Tritech Research | 60 mm T3308, 35 mm T3501 | |
| NGM agar | Various | 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4 | |
| S Media | Various | S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4. | |
| Dauer pheromone plates for dose-response assay | Various | Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying). | |
| Microsphere beads 0.1 micron | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 buffer | Various | Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving |
References
- West-Eberhard, M. J. . Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).
- Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , 739-768 (1998).
- Golden, J. W., Riddle, D. L. The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature. Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).
- Riddle, D. L., Wood, W. B. . The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).
- Fielenbach, N., Antebi, A. C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity. Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).
- Hu, P. J. . WormBook. , 1-19 (2007).
- Golden, J. W., Riddle, D. L. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, 578-580 (1982).
- Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).
- Jeong, P., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433, 541-545 (2005).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454, 1115-1118 (2008).
- Schroeder, N., et al. Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin. Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).
- Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans. Development. 138, 1371-1381 (2011).
- Albert, P. S., Riddle, D. L. Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva. J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).
- Vowels, J. J., Thomas, J. H. Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans. Genetics. 130, 105-123 (1992).
- Vowels, J. J., Thomas, J. H. Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 303-316 (1994).
- Ailion, M., Thomas, J. H. Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans. Genetics. 156, 1047-1067 (2000).
- Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. . Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Ouellet, J., Li, S., Roy, R. Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans. Development. 135, 2583-2592 (2008).
- Blelloch, R., et al. The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, (2012).
- Nelson, F. K., Riddle, D. L. Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery. J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Singh, R., Sulston, J. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
