Analisi Metabolomica di cervello di ratto da Alta Risoluzione Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare di estratti di tessuto

Modelli murini sono stati utilizzati estesamente nella ricerca sul cervello ^1. Correlazioni genotipo-fenotipo sono stati studiati nel topo e ratto cervello studiando l'espressione genica a RNA e / o livelli di proteine ​​da un lato, e fenotipi morfologici, funzionali, elettrofisiologiche e / o comportamentali dall'altro ^2-6. Tuttavia, per comprendere completamente i meccanismi che collegano fenotipo al genotipo, è indispensabile studiare gli eventi molecolari a valle di espressione della proteina, cioè. il metabolismo dei substrati biochimici su cui agiscono gli enzimi ^7. Questa esigenza ha portato, nel corso degli ultimi 10 o 15 anni, a una rinascita della ricerca metabolica in molti rami della biologia ^8,9. Mentre studi metabolici classici si sono spesso concentrati su dettagli di specifici percorsi, il nuovo approccio metabolomica è orientata verso un'indagine onnicomprensiva del profilo metabolico globale del tessuto in esame.Una conseguenza di questo concetto è un evidente bisogno di strumenti analitici che riducono al minimo pregiudizio verso specifici percorsi e / o classi di composti metabolici. Tuttavia, un saggio biochimico classica è basata su una particolare reazione chimica di un analita che deve essere specificato prima di eseguire il test. Per contro, tecniche spettroscopiche come la risonanza magnetica (NMR) nucleare e la spettrometria di massa (MS) (i) sono basati su particolari (fisici) proprietà molecolari di composti biochimici, ciascuna delle quali dà luogo ad uno o più segnali distinti in uno spettro rilevato nel corso di un esperimento; e (ii) rilevare un gran numero di diversi composti per esperimento.

Così, ogni spettro contiene le informazioni combinate di tutta una serie di metaboliti. Per questo motivo, i metodi spettroscopici sono strumenti adeguati per la metabolomica, in quanto nessuna selezione preventiva deve essere fatta per quanto riguarda la natura dell'analita da misurare ⁸ </sup>. Di conseguenza, queste tecniche naturalmente si prestano a studi esplorativi perché notevolmente facilitano l'individuazione di cambiamenti metabolici inaspettati.

Anche se la spettroscopia NMR e MS possono essere usati in modo intercambiabile per l'analisi di molti metaboliti, ogni metodo possiede vantaggi e gli svantaggi che sono stati recentemente recensito ¹⁰ specifici. In breve, la spettroscopia NMR di solito può essere eseguita da estratti grezzi e non richiede la separazione cromatografica di composti del campione prima dell'analisi. Al contrario, MS funziona con gas o cromatografia liquida (GC o LC) separazione, ad eccezione di particolari sviluppi recenti come l'imaging spettrometria di massa. In alcuni casi particolari, come l'analisi degli zuccheri, separazione LC può diventare una necessità per la spettroscopia NMR così, perché le linee di risonanza di zuccheri diversi si sovrappongono in modo significativo nel protone ⁽¹ H) spettri NMR. Tuttavia, spettroscopia ¹ H NMR senza chrseparazione omatographic rimane il più popolare quasi universalmente applicata metodo NMR metabolomica,. In generale, la preparazione del campione è più lungo e complesso per MS di quanto lo sia per la spettroscopia NMR. Gravi problemi dovuti agli effetti della matrice sono molto meno comuni in spettroscopia NMR che in Stati membri in cui essi possono condurre a segnali notevolmente attenuati. Metabolita quantificazione può essere ottenuto con entrambi i metodi. Tuttavia, sono necessari più composti standard per la SM a causa di variazioni di effetti matrice e l'efficienza di ionizzazione tra metaboliti. Al contrario, è necessario un solo standard per ogni campione per l'analisi spettroscopica NMR perché in condizioni di misura adeguate, il secondo metodo è intrinsecamente quantitative grazie alla risposta NMR strettamente lineare dai nuclei osservati. Un grave inconveniente di NMR è la sua relativamente bassa sensibilità. MS, in particolare, LC-MS, è più sensibile NMR di diversi ordini di grandezza; per questo motivo, MS è da preferire NMR per laanalisi dei composti presenti a concentrazioni molto basse. D'altra parte, la natura non distruttiva dell'esperimento NMR è un chiaro vantaggio rispetto MS; in questo modo, NMR può essere eseguita più volte sullo stesso campione, ad esempio, per i diversi nuclei NMR attivo come ¹ H, fosforo-31 ⁽³¹ P), carbonio-13 ⁽¹³ C), fluoro-19 ⁽¹⁹ F) etc., in quanto nessun materiale viene consumato da NMR rispetto alle misurazioni MS.

Sia NMR e MS possono essere impiegati in modi differenti, ognuno dei quali è ottimale per la rivelazione di composti con particolari caratteristiche chimiche. Per esempio, ³¹ P NMR è spesso più adatto di ¹ H NMR per l'analisi di composti fosforilati moderatamente concentrati, sebbene metaboliti fosforilati quasi tutti contengono anche protoni. Tuttavia, i loro segnali ¹ H NMR possono essere oscurate da ¹ H NMR i segnali provenienti da altri composti, non fosforilata, mentre il secondoovviamente non causano segnali di fondo in ³¹ P NMR. In una situazione analogico, analisi ¹⁹ F NMR è da preferire per i composti fluorurati, ad esempio, farmaci fluorurati (nessun segnale di fondo di metaboliti endogeni), mentre il caso speciale di ¹³ C NMR è di interesse quasi esclusivamente se il destino di ¹³ C deve essere seguita, a causa della estremamente bassa abbondanza naturale dell'isotopo ¹³ C (circa 1%) etichettati precursori metabolici esogeni. Molti spettrometri di massa operano in modalità ioni negativi o in modalità ioni positivi. Pertanto, è importante conoscere in anticipo l'analisi se gli ioni da osservare sono caricati negativamente o positivamente. Ci concentriamo qui su un protocollo per l'analisi del metabolome tessuto cerebrale da ¹ H e ³¹ spettroscopia NMR P perché questo metodo produce un gran numero di importanti concentrazioni di metaboliti a basso costo, in termini di (i) il tempo necessario per la preparazione del campione unnd (ii) lo sforzo richiesto per metabolita quantificazione. Tutti gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando l'attrezzatura di un laboratorio standard di wet-chimica e una struttura di spettroscopia NMR ad alta risoluzione. Ulteriori requisiti sono descritti nella sezione Protocollo di seguito.