Phosphopeptide Анализ грызунов придатка яичка сперматозоидов

Критические шаги для успешного и воспроизводимого протеомного анализа сперматозоидов являются: 1) чистота исходного материала; 2) удаление нежелательных солей и моющих средств; 3) денатурации белков в их полном объеме с тем, чтобы позволить трипсина переварить высокий выход белков и 4) сведение к минимуму образец обработки, чтобы уменьшить потерю пептида.

Для того чтобы успешно обратной промывки конского придатка, важно, чтобы найти область, из которой сперматозоиды выйдет. В случае как крысы и мыши, это на вершине вогнутой области, в середине хвостовой части придатка (рис 2а). Если человек приходит в дальнейшем к семявыносящих протоков, обратной промывки проще и вероятность успеха, как правило, выше. Тем не менее, это происходит из-за потери чисел спермы. С другой стороны, если попытаться переместить более проксимально к корпусу, то количество давление, необходимое, чтобы подтолкнуть сперматозоидов обратно через epididymAl каналы часто настолько высока, что повреждение придатка неизбежно происходит.

Обратной промывки из придатка традиционно выполняется с использованием насыщенного водой минеральное масло и сбалансированный солевой раствор в самой шприца в качестве средства для удаления сперматозоидов ^22-25. Обе процедуры являются потенциально проблематично из LC-MS. Во-первых, минерал, скорее всего, блокировать нано-C18 нано-столбцы, используемые в основном во всем мире для протеомики анализа и ухода должны быть приняты, чтобы никто не переносится в порядке. Если это происходит, то невозможно, чтобы продолжить, и образец, по существу, теряется. Эту проблему можно решить за счет использования КДО или других сбалансированных солевых растворов в шприц, однако, хотя это успешно, мы вскоре признано, что многие из сперматозоидов стать подвижными, как только раствор КДО вошел в контакт и смешивают с хвостового придатка клетки. Чтобы обойти эту проблему, мы просто с обратной промывкой сперматозоиды с воздухом. Мало того, что каченость сперматозоидов сравнима с методами на основе жидких, но количество совпадает.

Phosphoproteomics, пожалуй, один из немногих способов установить, какие сигнальные пути происходят в сперматозоидах после эякуляции. Одним из основных путей, которые мы исследуем это процесс капацитации. Сперматозоиды должны пройти "капацитации", прежде чем он способен связываться с яйцом. На практике это достигается в основном путем инкубации сперматозоидов в течение периода времени (40 мин мыши; крысы 1,5 ч; человек 3-24 ч) в растворе КДО с сывороточным альбумином. Ранее мы и другие показали роль киназ, участвующих в капацитации. Интересно, что удаление ПВА μ II производят мышей, сперматозоиды плавают спонтанно в пробирке, но не может пройти гиперактивацию ^26. Последнее отличительной чертой капацитации, в результате чего изменить сперматозоиды их бассейн шаблон с высокой скоростью, низкой амплитуды, чтобы низкийскорость, высокая амплитуда частоты биений. Мы показали, ниже по течению киназ, участвующих в этом процессе, включают pp60-регулированию рынка ценных бумаг (SRC) ^13,27 C-да ²⁸ и С-ABL ^14. Интересно, что ингибирование SRC останавливается капацитации-зависимой фосфорилирование тирозина ^13. Тем не менее, это может быть преодолено с окадаевой кислоты, предполагая, что SRC не принимает непосредственного участия в общем начала фосфорилирования тирозина ^29, но может регулировать фосфатазы ^29. Проблема с использованием КДО в качестве средства, чтобы заставить сперматозоиды из придатка яичка является то, что после активации, мыши сперматозоиды только занимает приблизительно 40 минут, чтобы правомочным. Учитывая, что изоляция сперматозоидов может занять 5 мин / мыши и часто несколько мышей используются в эксперименте, то сперматозоиды будут находиться на разных стадиях зрелости в начале эксперимента. Чтобы преодолеть это давление воздуха может быть использован, чтобы подтолкнуть сперматозоидов из хвостовой придатка в стеклянную канюлю. Не только все Inact спермыив и, по сути, как они будут найдены в хвостовой среде, он позволяет сравнить неподвижные и подвижные phosphoproteomics.

Пример обработки для phosphoproteomics должно быть сведено к минимуму при сравнении сперматозоидов в двух разных функциональных состояниях. Использование метанола хлороформа по сравнению с другими традиционными методами осаждения белка 1) уменьшает потребность в дополнительных стадий промывки, 2) удаляет почти все следы солей и жиров и 3) имеет доказал свою способность к осаждению низкие белки обилие над ГТС ^19. Белок осадков до трипсина пищеварения рекомендуется, так как не только делает эту помощь для денатурации белка (который помогает трипсин-переваривание), но снимает многие из MS-несовместимых метаболитов, присутствующих в клетке.

Сравнение спермы фосфопептидов может быть сделано в ряде направлений. На базовом уровне, простого сравнения выявленного фосфопептидом в одном образце того, в другомобразец в процессе, известном как "спектральной подсчета" может быть сделано. Однако критика была в таком подходе в основном тем, что ранние протеомные исследования с использованием низких повторов (более подробное обсуждение см Lundren и др. ^30). Более сложный способ смотреть на интенсивность пептидной материнской массы и сравнить это с другими образцами (без наклеек сравнения). В примере, показанном на фиг.4, пептид отсутствует в от неподвижных (фиг.4 вверху), но присутствует в подвижных (фиг.4 снизу) сперматозоидов из м / г 650-670 могут быть видны. Этот процесс, называемый этикетки МС на основе свободного количественного стратегия этикетки свободной.

Альтернативной стратегией обычно используется, чтобы уменьшить количество трасс, необходимых для количественного протеомики заключается в использовании изотопов. Как масса изотопа отличается, масс-спектрометр может быть использован для сравнения интенсивности в Elutчисле пептидов. Тем не менее, в отличие от большинства других типов клеток, некоторые изотопной метки не могут быть применены к сперматозоидов. Например, добавление стабильных изотопов (один тяжелый изотоп будет добавлен в одном образце, в то время как более легкий вариант будет добавлен к другому) могут быть использованы в культуре ткани. При изотопы получают включены в белка, анализ протеомики могут быть выполнены с помощью комбинирования двух образцов (мультиплексирования). Тем не менее, в случае сперматозоидов, это не может быть сделано, просто в силу того, что 1) изотопной метки требуется несколько проходов (до 8) в культуре ткани и 2) клетки спермы не имеет ядерного транскрипцию генов и перевод, и, следовательно, они не могут включать изотопов во всех их белка в любом случае. Один из способов обойти это заказать меченые мышей, однако, они, как известно, дорого. Альтернативный подход состоит в использовании химическую метку. Это было сделано, когда не-капаситированных мышей по сравнению с капаситированных мышей. В этом случае, D ₀ и D <sub> 3-метка была использована, чтобы различать одного образца и другую в масс-спектрометре ^31. Другие подходы могут включать в себя использование iTRAQ (изобарической тега для относительного и абсолютного количественного), в результате чего остатки лизина помечены в химическую реакцию с различными массовыми изотопов; ICAT (изотоп закодированы аффинная метка), причем цистеина помечены различными массовых изотопов и тяжелой и легкой маркировки воды.

В каждом конкретном случае, однако, одна вещь, нужно иметь в виду,. MS сообщает только то, что присутствует в образце, и это отражение всего, что случилось с этим дискретизации до этой точки. Минимизация обработки образца при максимальном выход на каждом шаге необходимо для успешного протеомики анализа.