Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Традиционно, выражение вирус изучается с помощью молекулярных методов (например, северная блоттинга, вестерн-блоттинга, микрочипов гибридизации, и т.д.) Биология ^1. Хотя эти методы способны обеспечить подробную информацию относительно классификации изменений экспрессии отдельных мРНК или белков, они, как правило, не поддаются реального времени и высокой пропускной процессов. Альтернативные подходы с помощью флуоресцентной основе журналистам были применены ранее при работе с поксвирусов; Однако, их развитие и использование, был мотивирован разнообразных целей. Несколько таких методов были разработаны для отбора рекомбинантных вирусов ^2,3. Эти методы выразить EGFP при правильном включении и экспрессии экзогенной ДНК из рекомбинантных коровьей клонов. Аналогичным образом, несколько штаммов вируса осповакцины, стабильно экспрессирующие растворимый EGFP или GFP с метками белки, экспрессированные под нативного промотора коровьей оспы были широко использованы. Это типчески используется для количественной запись вируса и репликации во время на основе антител нейтрализации анализов, химическую ингибирование, или сравнение противовирусной эффективности ^4-6. В то время как эти вирусы оказались полезными, они ограничены в своей способности обеспечить подробную информацию о точке торможения из-за их использования одного неоднозначного начале / конце вирусного промотора. Предыдущие методы также использовали EGFP белка с субоптимальными сигнал-шум характеристик.

Из-за сложности поксвирусной репликации и отсутствием существующих инструментов, доступных для анализа изменений в режиме реального времени в экспрессии вирусных генов, мы разработали набор одно-и многоступенчатый репортер вирусов ^7,8. Как описано в предыдущих публикациях, эти вирусы выразить один, два, или три спектрально различных флуоресцентных белков из родных промоутеров коровьей во время рано, промежуточные или поздно этапы инфекции. Эти вирусы могут быть намред качестве индикаторов прогресса репликации вируса с помощью флуоресцентного микроскопа, и они одинаково хорошо подходит для высокой пропускной пластина-и-ридер на основе анализов. Эти вирусы очень легко использовать вместо вируса дикого типа, растет с аналогичными кинетики достичь эквивалентные титры ^7. В ходе планирования и создания этих вирусов, гораздо внимание было уделено в выборе флуорофоры, которые имеют высокий сигнал-фон характеристики с превосходной эффективности складной для облегчения надежную количественную с быстрым обратной связи с изменениями в выражении (Венера, mCherry и TagBFP). Кроме того, комбинации вирусных промоутеров были выбраны, которые производят высокую точность, однозначное выражение этап конкретных, предоставляя информацию о полном диапазоне рано (C11R промоутер), промежуточный (G8R промотор) и поздний (F17R промоутер) экспрессию генов, в отличие от неоднозначной ранний / поздний промоторы.

Эти вирусы могут быть использованы в качестве инструмента для INVEstigating жизненный цикл прототипа поксвирусной, вирус коровьей оспы. Многое до сих пор не известно о хозяине-вируса взаимодействия, несмотря на свою долгую историю изучения. Коровьей оспы является сложной, выпускающее более 200 уникальных белков, многие из которых являются иммуномодулирующее и принимающих антагонистическими. При заражении вирус коровьей оспы немедленно начинает транскрипцию мРНК раннее. Этому способствует РНК-полимеразы и транскрипционных факторов, которые были загружены на вирусного генома в ходе вириона упаковки и не состоявшихся в приостановленном состоянии до последующей инфекции. Это раннее выражение в основном производит белки, необходимые для подавления иммунной системы хозяина (мРНК decapping, секвестрации дцРНК, и приманки рецепторных белков, а также в качестве ингибиторов апоптоза, реакции стресс, и Toll, IL, и сигнализации NF-kB) и геном репликации. Рано выражение также производит транскрипционные факторы, необходимые для промежуточного выражения. Промежуточный выражение включает экспрессию конце факторов этап транскрипции. Этовыражение каскад приводит к производству структурных и ферментативных белков вируса на поздних стадиях инфекции, которые необходимы для полной сборки зрелого коровьей оспы вириона.

Наш набор флуоресцентных репортер вирусов позволяет быстро добиться прогресса в понимании поксвирусной биологии. Один из наиболее распространенных и трудоемких методов в области вирусологии является анализ роста. Это обычно включает инфицировать клетки, принятие ряд процедур, вирус уборочной лизированием инфицированные клетки, и количественной полученный титр вируса на бляшек. Использование репортерных вирусы, описанные здесь позволяет в режиме реального времени измерение роста вируса, который может быть легко проанализированы и сравнены между многочисленных процедур, выполняемых параллельно. Мы предполагаем этот набор реагентов будет использоваться в различных протоколов для определения изменений в экспрессии вирусного гена в ответ на обработку препарата, RNAi кnockdown или диапазон хозяин ограничение.

Этот метод также позволяет проводить анализ высокого содержания в большем масштабе, чем ранее доступные, что позволяет с высокой пропускной противовирусных лекарств для экранов конкретно определенных целевых стадий интерес. В то время как многочисленные потенциальные обработки по борьбе поксвирусной инфекции были выявлены, только FDA одобрило терапии эффективные для лечения поксвирусной инфекции являются ациклические фосфонатный нуклеозид, Цидофовир, и лечение с иммуноглобулин коровьей оспы ^9,10. Несмотря на ликвидации оспы в 1977 году ^11, поксвирусы остаются серьезной угрозой для здоровья человека ^12. Прекращение широкого вакцинации против вируса натуральной оспы привело к повышенной восприимчивости к другим поксвирусов ^13. Например, регионы Центральной Африке ранее защищенные вакцинации переживают всплеск вирусных инфекций Обезьянья ^14. Значительное беспокойство также был, заданный в отношении скрытой предрасположенности к преднамеренного высвобождения вируса натуральной оспы. В связи с ограниченностью методов лечения в настоящее время, существует настоятельная потребность в разработке новых методов лечения. Эти вирусы репортер позволяют быстро и высокопроизводительного скрининга малую молекулу ингибитора для ингибирования определенной стадии вирусной репликации. Идентификация ингибиторов, предназначенных вирусные этапы экспрессии в настоящее время не является целью торможения будет способствовать развитию комбинированной терапии с повышенной эффективностью.

Многое можно почерпнуть о биологии коровьей оспы клеток, наблюдая изменения в экспрессии генов для каждого этапа,. Ослабление в химической или генетической манипуляции с инфицированной клетки-хозяина, как правило, выражается в виде сокращения вирусных титров. Тем не менее, путем сравнения изменения в каждой стадии вирусной экспрессии каскада, можно получить более полное понимание того, как вирус подготовка является воздействиеред конкретным лечения. Эти данные, как было показано, хорошо коррелирует с традиционным выхода титра вируса, но предоставить более подробную информацию механистическую, а также высокой пропускной способности ^7.