Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител
Summary
Метод описан с визуальным сопровождением для проведения масштабируемых, выбор пропускной способности от фаговых дисплеев комбинаторных синтетических библиотек антител против сотен антигенов одновременно. С помощью этого параллельного подхода, мы выделили фрагменты антител, которые обладают высоким сродством и специфичностью в отношении различных антигенов, которые являются функциональными в стандартных иммунологических.
Abstract
Спрос на антитела, которые отвечают потребностям обоих фундаментальных и клинических исследований применения является высоким, и резко возрастет в будущем. Тем не менее, очевидно, что традиционные технологии моноклональные не одни до этой задачи. Это привело к развитию альтернативных методов для удовлетворения спроса на высокое качество и возобновляемых аффинных реагентов на всех доступных элементов протеоме. С этой целью, высокие методы пропускную способность для проведения отрывки из синтетических библиотек антител фагов отображается были разработаны для приложений, связанных разнообразные антигены и оптимизирован для быстрого пропускной способности и успеха. При этом протокол описан подробно, иллюстрирующий с видео демонстрации параллельный выбор Fab-фаговых клонов из библиотеки высоких разнообразия от сотен мишеней с использованием либо ручного обработчик жидкости 96 канала или автоматизированной системы робототехники. Используя этот протокол, один пользователь может генерировать сотни антигенов,выберите антител к ним в параллельных и проверки связывания антитела в течение 6-8 недель. Выделенные: я) жизнеспособным формат антиген, II) предварительный отбор антиген характеристика, III) важные шаги, которые влияют на выбор конкретных и высокое сродство клонов, и IV) пути повышения эффективности отбора мониторинга и раннего этапа антитела клона характеристики. При таком подходе, мы получили синтетические фрагменты антител (Fab-фрагменты) многих целевых классов, включая однопроходных мембранных рецепторов, секретируемого белка гормонов, и нескольких доменов внутриклеточных белков. Эти фрагменты могут быть легко преобразованы в полноразмерные антитела и были проверены на демонстрируют высокое сродство и специфичность. Кроме того, они были продемонстрированы, чтобы быть функциональным в различных стандартных иммунологических включая Вестерн-блоттинга, ELISA, клеточного иммунофлуоресценции, иммунопреципитации и связанных с ними анализов. Эта методика позволит ускорить открытие антител и, в конечном счете приблизить нас к реализации цели OF генерации возобновляемой, высококачественные антитела к протеоме.
Introduction
С наступлением постгеномная возраста, наличие высококачественных связывающих реагентов для характеристики и модулировать белки важно, чтобы открыть новое исследование и терапевтические направления. Антитела продолжать иметь решающее значение для академических и промышленных исследователей как основной исследовательских и диагностических средств и потенциальных терапии. Не удивительно, что уже впечатляющий рост фирм по разработке договора антител, большинство из которых полагаются на традиционных технологий гибридом для получения пользовательских антитела. Тем не менее, выбор в пробирке с использованием фаговых дисплеев, библиотек антител становится мощной альтернативой технологии, что может предложить уникальные преимущества и успеха там, где обычные технологии могут столкнуться ограничения 1, 2.
В свете значительного спроса на высококачественные антител в качестве научно-исследовательских инструментов, двух основных проблем для генерации возобновляемой антитела являются: 1) выбор пропускной способности и 2) антиген А. В.ailability. Количество групп уже описаны в пробирке отбора трубопроводов, направленных на повышение пропускной способности и скорости идентификации антител. Эти подробные описания различных жизнеспособных подходов, которые включают выбор на любой полной длины цели 3,4 или структурно связаны домены 5,6,7, используя либо шарик на основе 6,8 или пластины на основе 3,4 схемы антиген иммобилизации. Кроме того, растет применение технологий синтеза генов 9 составил систематический генерацию антиген, в частности, из изолированных областей, достаточно рентабельным и потенциально может облегчить трудности в получении достаточных количеств очищенного, полноразмерного антигена. С помощью этих двух технологий в тандеме, самодостаточным и масштабируемой поколение антиген и выбор антитело трубопровод был разработан, что позволит параллельно выделения антител для больших наборов выраженных антигенных доменов и способствовать развитию реагентов для чаracterizing целые классы структурно или функционально родственных белков.
С этой целью, с интегрированной трубопровода, которая соединяет в идентификации силикомарганца экспрессируемой доменов антиген, синтез гена с высокой пропускной бактериальной экспрессии антигенов и масштабируемых антител выборов фаговых дисплеев была разработана. Этот трубопровод требуется только базовую инфраструктуру доступной для большинства жизнь научных лабораторий (в том числе библиотек антител, которые более доступны через лицензии или соглашение о передаче материала), но также поддается автоматизации для использования в промышленных масштабах. Используя этот протокол, можно генерировать сотни сродства с метками антиген домены, и обычно изолируют высокой конкретных фрагментов антител на многие из этих антигенов.
Технологии фагового дисплея показан продемонстрировали совместимость с широким спектром форматов рекомбинантных сродством реагентов, включая Fab, ScFv и автономных областей Fv и Арастет массив малых "альтернативных схем» (по проекту анкириновых повторных белков (белков DARP), фибронектин (FN), Липокалин доменов и более 10). Обсуждение ограничивается в этом примере к выделению фрагментов Fab антитела, хотя предполагается, эти методы могут быть адаптированы к другим типам библиотек. Используя эту технологию, заводы с низкой наномолярном сродством к небольшой, меченый белок домены, включая фактор транскрипции доменов, SH2 доменов, РНК-связывающие белки и другие были успешно выбранных, многие из которых связывают полноразмерного белка и являются функциональными в иммунологических, таких как иммунофлюоресценции , иммунопреципитация и иммуногистохимия. Важно отметить, что рекомбинантные обязательные клоны полностью возобновляемых источников и может быть повторно генерируется из выражения строит с помощью бактериальная продукция размещения большего единообразия, воспроизводимости и экономической эффективности, тем самым оправдывая расходы строгой проверки клона.
В этом протocol и сопровождающие видео, основные методы отбора антител из фаговых дисплеев библиотек, использующих иммобилизованным антигеном домены продемонстрированы. Данный метод использует GST-меченый белок доменов в неподвижном пассивной адсорбции в Планшетный, хотя другие теги 11,12,13 и форматы выбора 13,14,2 также успешно используется. Критические соображения для установки и проведения выборов с параллельным мониторинга параметров отбора, направленного на выявление и выделение специально обогащенные клоновых антитела для проверки подробно.
Protocol
Representative Results
Discussion
При проведении в пробирке выборов антител, два основных факторами успеха выбора являются: 1) изоляция хорошо сложенными антигенных мишеней для выбора на и 2) наличие высокой библиотеки функциональной разнообразие антител. Во многих случаях, наличие достаточных количествах хорошо …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать NIH Общий фонд – белка Захват Реагенты программы для финансирования развития рекомбинантного антитела выбор сети антитела и характеристика трубопровода и Канадского фонда инноваций для финансирования покупки роботизированной платформы выбора.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
