ScanLag: High-throughput Quantificazione del Colony crescita e ritardo

Come esempio di estrazione distribuzione ritardo, la Figura 5 mostra la capacità di ScanLag di identificare e tracciare ogni colonia con caratteristiche specifiche in un'unica piastra nel tempo, come avverrebbe in un saggio di screening. Quando la coltura del microorganismo è eterogeneo, le diverse sottopopolazioni potrebbero si rivelano durante il dosaggio. Ad esempio, la Figura 6 mostra la quantificazione aspetto e mostra una distribuzione bimodale ritardo in un ceppo mutante di E. così coli. Il tasso di crescita delle cellule influenza il tempo di comparsa della colonia. Quando le colonie crescono alla stessa velocità, il ritardo aspetto può essere attribuito al ritardo (Figura 7). Per convalidare che il metodo effettivamente misura il tempo di ritardo di singole cellule, abbiamo confrontato i risultati ScanLag con quelli ottenuti usando la microscopia a cella singola; questa convalida è discribed in dettaglio in una pubblicazione precedente 7. Questo metodo consente il monitoraggio di molte più celle che possono essere valutati con microscopia. Le distribuzioni ottenute mediante microscopia e ottenuti con ScanLag in gran parte si sovrappongono. La distribuzione ScanLag è leggermente più ampio; analisi teoriche prevedono ampliare essere dell'ordine della deviazione standard del tempo di divisione. Se il tempo di crescita è diverso per ogni ceppo, l'origine del ritardo nella comparsa deve essere ulteriormente studiata utilizzando altri metodi. L'influenza dei primi, che appare colonie l'aspetto delle colonie più tardi è stato esaminato. Esperimenti di controllo 7 confermato che successiva comparsa non è stata influenzata purché il numero totale di colonie per piastra non superava 200 (Figura 8). Un altro esperimento di controllo ha confermato che la posizione della colonia sulla piastra non influenzava il suo tempo aspetto 7. L'analisi della ptardive è tarato per soglie specifiche che potrebbero aver bisogno di modifiche a seconda delle sostanze nutritive presenti nel terreno di coltura o il tipo di microrganismo. Tuttavia, l'analisi è molto robusto per una vasta gamma di soglie, come mostrato nella Figura 9. Figura 1. Un diagramma schematico dei passi necessari per creare una distribuzione aspetto colonia. Figura 2. Una schermata di Gestione periferiche mostra i nomi degli scanner collegati, e del file di configurazione. cliccate qui per vedere una più grandeversione di questa figura. Figura 3. Un'immagine del Gestore Scanning. Figura 4. Un'immagine del ScanLagApp. Un'immagine della piastra sia nel riquadro di sinistra, e le curve di crescita di ogni colonia sono nel riquadro di destra, come indicato nel manuale. Le punte in alcune delle curve zona colonie si verificano quando due o più colonie si fondono. Quando la fusione di colonie accade, l'area di queste colonie è considerata come la zona del giunto. Figura 5. Un risultato rappresentativo dell'analisi di una piastra. (A) Un'immagine del output dell'applicazione rilevamento alla fine dell'esperimento. Ogni area colonia è identificata, colorata e assegnato un numero ID univoco. Le frecce indicano le colonie rappresentative misurato in B. viene rilevata La colonia basata sulla soglia d'intensità (per colonie di E. coli su LB agar agar o M9 questa soglia è 0,03. Per altri supporti o batteri, questa soglia può essere regolato in funzione ProcessPictures ). Solo gli oggetti superiori a 10 pixel sono contati (questa soglia può essere modificata nei MatchColonies funzione). Rilevamento di una colonia inizia a circa 10 5 batteri. (B) Lotto di zona in pixel in funzione del tempo di quattro colonie di rappresentanza in questo piatto. Il 'tempo di comparsa' di ogni colonia è quando viene rilevata la colonia. Il 'tempo di crescita' di ogni colonia è qui definito come il tempo di crescere indietrom 20 pixel a 80 pixel (quei confini sono regolabili mediante la funzione getAppearanceGrowthByVec). Il software esclude le colonie che fuse prima di raggiungere il limite superiore. Identificazione di una colonia specifica in base alle sue caratteristiche è facile grazie al numero di identificazione e il colore assegnato ad ogni colonia. Per esempio COLONIE # 1, 56, 77 e 124 sono evidenziate in entrambi i grafici. Figura 6. Aspetto quantificazione può rivelare bimodale distribuzione del tempo di ritardo. Confronto tra analisi ScanLag istogrammi dei tempi di presenza per i due ceppi diversi. Linea blu: ceppo selvatico in crescita esponenziale (totale: 1.320 colonie); line-alta rossa persistenza mutante arricchito con batteri in ritardo di sviluppo (totali: 1.529 colonie). (A) istogrammi aspetto normalizzate. Il piccodi comparsa di cellule in crescita esponenziale è il tempo tipico di crescere per una colonia rilevabile. Inserto: stesso istogramma del ceppo mutante dopo aver sottratto il tempo del picco della cultura esponenziale per ottenere il tempo di ritardo reale sul bidoni log-distanziati mostrano la distribuzione bimodale ritardo. (B) Funzione di sopravvivenza degli stessi dati come in (A) su una scala logaritmica. Questa rappresentazione migliora l'aspetto coda tardiva del ceppo mutante. Figura 7. Distribuzione Aspetto e distribuzione del tempo di crescita. (A) e (B) mostrano due istogrammi dimensionali del tempo aspetto e il tempo di crescita delle due condizioni diverse (il software esclude colonie che si sono fuse prima di raggiungere il limite superiore). (C) Confrontando gli istogrammidei due ceppi mostrano la differenza di tempo aspetto, considerando che i tempi di sviluppo (D) sono simili. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 8. L'aspetto delle prime colonie non interferisce con la comparsa di colonie successive. (A) lag distribuzione temporale delle cellule wild-type placcati solo. (B) lag distribuzione temporale di un ceppo sensibile a freddo da sola, dopo il trasferimento alla temperatura permissiva. (C) lag distribuzione temporale dei due ceppi intrecciate fra loro alle stesse condizioni. La linea nera rappresenta la distribuzione prevista sulla base dei dati ottenuti durante la misurazione ogni ceppo separatamente. Un buongreement tra distribuzioni attesi e misurati è ottenuto purché il numero totale di colonie per piastra è inferiore a 200. .. Figura 9 La soglia di rivelazione non influisce sulla forma della distribuzione comparsa colonia La distribuzione comparsa colonia è stata analizzata per lo stesso insieme di dati utilizzando due diverse dimensioni di soglia; (A) dimensione di soglia è di 10 pixel; (B) dimensione di soglia è di 50 pixel. Numero di celle per dell'istogramma: ca. 1.500. La soglia di rilevamento risultati differenti solo in uno spostamento del tempo di rilevamento. Figura 10. Temperatura misure di stabilità across superficie dello scanner. (A) immagine di una targa con colonie di subtillis Bacillus coltivati ​​sullo scanner senza Power Management. La superficie è più calda sul fondo e quindi le colonie crescono più velocemente. La linea progressiva accanto al piatto è una rappresentazione schematica del gradiente termico. (B) La stabilità della temperatura è stata misurata con due termocoppie poste sulla superficie dello scanner. Lo scanner si riscalda durante ciascuna scansione e nel tempo. (C) Con Power Management, la temperatura è uniforme e le colonie crescono a tassi simili. (D) Come (B) con il modulo Power Management. Stabilità di temperatura di ± 0,2 ° C. Figura 11. Differenze nella distribuzione apparenza possono essere dovute a differences di volumi di terreno solido. La stessa coltura batterica è stata piastrata su piastre con diversi volumi di LB agar, risultante in una diversa altezza della superficie agar. Le diverse altezze portato a diversi opacità delle piastre, e quindi un tempo di rilevamento diverso. La differenza tra le piastre è stata controllata e la differenza tra diverse condizioni altezza. (A) le differenze tipiche tra le lastre di volumi uguali di 30 ± 0,5 ml di LB Agar. (B) Differenza tra differenti condizioni di altezza: la distribuzione apparizione è stata misurata per piatti con volumi di 20 ± 0,5 ml (rosso), di 30 ± 0,5 ml (verde) e di 40 ± 0,5 ml (blu). Ogni condizione è la media di 6 piatti differenti. Fintanto che il volume delle piastre è entro ± gamma 5 ml, l'opacità è simile e porta a tempo aspetto simile distribuzione.