Summary

Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

Published: April 03, 2014
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Summary

El protocolo descrito en el presente documento tiene como objetivo explicar y limite los numerosos obstáculos en el camino de la ruta intrincada que conduce a trifosfatos de nucleósidos modificados. En consecuencia, este protocolo facilita tanto la síntesis de estos bloques de construcción activados y su disponibilidad para las aplicaciones prácticas.

Abstract

La estrategia tradicional para la introducción de funcionalidades químicas es el uso de la síntesis en fase sólida añadiendo precursores de fosforamidita adecuadamente modificados a la cadena naciente. Sin embargo, las condiciones utilizadas durante la síntesis y la restricción de las secuencias más cortas dificultan la aplicación de esta metodología. Por otro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados son bloques de construcción que se han empleado para la introducción suave de numerosos grupos funcionales en los ácidos nucleicos, una estrategia que allana el camino para el uso de ácidos nucleicos modificados en una gama de colores amplia de aplicaciones prácticas activan tales como etiquetado funcional y generación de ribozimas y ADNzimas. Uno de los principales desafíos reside en la complejidad de la metodología que conduce al aislamiento y caracterización de estos análogos de nucleósidos.

En este artículo de vídeo, se presenta un protocolo detallado para la síntesis de these análogos modificados utilizando fósforo reactivos (III) con sede en. Además, el procedimiento para su caracterización bioquímica es divulgada, con un énfasis especial en las reacciones de extensión de cebador y polimerización del tizón TdT. Este protocolo detallado será de utilidad para la elaboración de dNTPs modificados y su uso posterior en la biología química.

Introduction

Trifosfatos de nucleósidos 5'-((d) PNT) representan una clase de biomoléculas vitales que están implicadas en incontables procesos y funciones que van desde ser la moneda universal de energía a los reguladores del metabolismo celular. Además de su papel en estas transformaciones biológicas fundamentales, sus homólogos modificados han avanzado como una plataforma versátil y suave para la introducción de grupos funcionales en oligonucleótidos, una metodología que complementa muy bien la síntesis en fase sólida automatizada que por lo general se aplica 1,2. De hecho, siempre que las (d) los PNT pueden actuar como sustratos para ARN y ADN polimerasas 3, una gran cantidad de grupos funcionales que incluyen aminoácidos 4-13, ácidos bórico 14,15, nornbornene 16, residuos diamondoid-17, como parte de las cadenas de organocatálisis 18, los ácidos biliares 19, e incluso oligonucleótidos 20 se puede introducir en oligonucleótidos.

_content "> Más allá de lo que representa un vector conveniente para la funcionalización de los ácidos nucleicos, dNTPs modificados pueden acoplarse en SELEX y otros métodos combinatorios relacionados de selección in vitro para la generación de ácidos nucleicos catalíticos modificados 21-30 y aptámeros para diversas aplicaciones prácticas 10, 31-36. Las cadenas laterales adicionales que se introducen por la polimerización de los dNTPs modificados se cree que aumentar el espacio químico que puede ser explorado durante un experimento de selección y complementar el bien pobre arsenal funcional de ácidos nucleicos 37. Sin embargo, a pesar de estos rasgos atractivos y los recientes progresos realizados en el desarrollo de tanto sintéticos como los métodos de análisis, universalmente aplicable y el procedimiento de alto rendimiento existe para la elaboración de nucleósidos trifosfato modificados 2,38.

El objetivo del presente protocolo es arrojar luz en la (a veces) los procedimientos intrincados líder to la síntesis y caracterización bioquímica de estos bloques de construcción activados (Figura 1B). Se hará especial hincapié en todos los detalles sintéticos que a menudo son difíciles de encontrar o están ausentes en tramos experimentales, pero que son, pero crucial para el buen fin de la ruta sintética que conduce al aislamiento de (d) los PNT puros (Figura 1).

Protocol

1. Síntesis de los trifosfatos de nucleósido modificado El enfoque sintético elegido sigue el procedimiento desarrollado por Ludwig y Eckstein ya que este método es generalmente fiable y conduce a muy pocos subproductos secundarios (Figura 1A) 39. Coevaporate el nucleósido protegido adecuadamente-3'-OAc (típicamente 0,1 mmol) dos veces con piridina anhidra (2 ml) y después se seca a vacío durante la noche. Al mismo tiempo, pirofosfato de tri…

Representative Results

Trifosfatos de nucleósidos modificados son atractivos objetivos sintéticos ya que permiten la introducción fácil de una gran variedad de grupos funcionales en los ácidos nucleicos 41. Sin embargo, el aislamiento y la caracterización de estos bloques de construcción activados es frecuentemente revelado a ser ardua. En consecuencia, se cree que los resultados que se muestran en este documento para ofrecer una mano de ayuda para seguir los diferentes pasos dentro de los procedimientos sintéticos y bioqu?…

Discussion

La inclusión de las modificaciones en los ácidos nucleicos es de interés para numerosas aplicaciones prácticas, incluyendo el desarrollo de agentes antisentido y antigenes 42,43, el etiquetado y el marcado funcional de oligonucleótidos 41, y en los esfuerzos para ampliar el alfabeto genético 44-46. Las alteraciones químicas y grupos funcionales son por lo general introducidos en ácidos nucleicos mediante la aplicación de protocolos de síntesis en fase sólida estándar y automa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Becas n ° PZ00P2_126430 / 1 y PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann se agradece para proporcionar el espacio y equipo de laboratorio, así como por su constante apoyo. La Sra. Sue Knecht se reconoce para un debate fructífero.

Materials

tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.

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Cite This Article
Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

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