Juxtasomal Biocytin Маркировка для изучения структуры-функции и отношение отдельных корковых нейронов
Summary
Чтобы понять структуру нейронных сетей, функциональный и морфологическое описание отдельных нейронов является необходимостью. Здесь мы демонстрируем juxtasomal biocytin маркировку, которая позволяет электрофизиологические записи во внеклеточной конфигурации, все же сохраняя способность внутриклеточно маркировать нейрон для пост специальной реконструкции дендритных и аксонов архитектуры.
Abstract
Кора головного мозга характеризуется множественными слоями и многих различных типов клеток, которые в совокупности как сеть ответственных за многих высших когнитивных функций, включая принятие решений, сенсорной наведением поведения или памяти. Чтобы понять, как такие сложные нейронные сети выполнять такие задачи, важным шагом является определение функции (или электрическую активность) отдельных типов клеток внутри сети, преимущественно, когда животное выполняет соответствующую познавательную задачу. Кроме того, не менее важно определить анатомическую структуру сети и морфологического архитектуры отдельных нейронов, чтобы позволить обратного проектирования кортикальной сети. Технические прорывы, доступных сегодня позволяют записывать клеточную активность в просыпаются, ведут себя животные с ценным возможностью постфактум идентифицирующей записанные нейронов. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal biocytin, которая включает действия записи Potentiаль пики в конфигурации внеклеточный (или плохо-патч), используя обычные патч пипетки. Конфигурация записи juxtasomal является относительно стабильным и применимы ко поведенческих условий, в том числе под наркозом, в отключке, проснулся голова фиксирована, и даже в свободно движущейся животного. Таким образом, этот метод позволяет подключить сотового типа конкретных действий потенциального пики во время поведения животных к реконструкции отдельных нейронов и в конечном счете, всей корковой микросхемы. В этом видео рукописи, мы покажем, как отдельные нейроны в конфигурации juxtasomal могут быть помечены biocytin в уретанакрилового наркозом крысы для идентификации сообщение специальной и морфологической реконструкции.
Introduction
Нейронные сети состоят из нескольких типов клеток, характеризующихся высокой специфичностью морфологических и физиологических свойств 1-7. Как следствие, отдельные типы клеток выполнять специальные задачи в рамках сети (см., например Женте соавт. 8 и Burgalossi соавт. 9). Мы только начинаем понимать, типоспецифические функции клеток через нейронных сетей и многое еще предстоит открыть. С этой целью многие лаборатории реализации экспериментальных подходов, которые позволяют анализ морфологических свойств одного и того же нейронов популяции, из которой физиологические параметры были получены 1,10-15. Здесь мы демонстрируем технику маркировки juxtasomal 16,17, который включает электрофизиологические записи, используя обычные патч пипетки во внеклеточной (таким образом неинвазивной) конфигурации в сочетании с электропорации записанного нейрона с biocytin.Основное преимущество этого подхода состоит в том, что неинвазивный характер гарантирует, что потенциал действия пики из отдельных нейронов записывается без изменения (например, диализом) внутриклеточное содержание ячейки. Вслед за электропорации, подход juxtasomal предоставляет возможность постфактум идентификации клеток и реконструкции на ссылку функцию (физиология) структуре (морфологии). Как правило, морфологическая реконструкция включает в себя реконструкцию дендритных и аксонов морфологии который может быть продлен до количественной оценки плотности позвоночника и / или Bouton или даже реконструкции нейронов морфологии в нанометровым разрешением с помощью электронной микроскопии. Методика записи juxtasomal может быть использован для записей в естественных условиях различных типов клеток по всей слоев коры или в суб-области коры головного мозга в диапазоне видов, хотя большинство исследований применен метод в мелких грызунов, таких как мыши или крысы. Наше исследование сосредоточено на записи и маркировка нейроныкрысы первичной соматосенсорной коры (S1) и включает в себя визуальную идентификацию зарегистрированных нейронов 18, дендритные реконструкции в сочетании с точной регистрации в стандартизированной системе отсчета перепроектировать корковых сетей 4,19 и подробную реконструкцию аксонов архитектуры охарактеризовать тип конкретных клеток местный и проекция дальний цели 20.
По сравнению с альтернативными естественных условиях методов в записи (внутриклеточных или целых клеток), juxtasomal записи относительно стабильны и поэтому могут быть применены через поведенческих состояний в том числе под наркозом 21,22, седативные 14, Awake головой фиксированной 23, или даже свободно движущихся Животные 9 . Здесь мы покажем juxtasomal маркировку в S1 из уретана наркозом крысы, хотя мы подчеркиваем общую применимость этого метода для многих препаратов выбора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод juxtasomal позволяет записывать в естественных потенциала действия пики от отдельных единиц по всей поведенческих условий (под наркозом, проснулся голова фиксированной или свободно перемещаться) с возможностью biocytin маркировки записанного нейрон для почтового типа Прямое …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить проф. Huibert Mansvelder и Берт Sakmann за всестороннюю поддержку, доктор Марсель Оберлендер за плодотворные обсуждения и предоставления нейронов трассировку и Брендан Лоддер для оказания технической помощи. Данные были приобретены с помощью ntrode VI для LabVIEW, щедро предоставленную Р. Бруно (Колумбийский университет., Нью-Йорк, США). Это исследование было поддержано Общества Макса Планка и Бернштейна Центра вычислительной неврологии, Тюбинген (финансируемого Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF; ФКЗ: 01GQ1002)) (RTN), Центр Neurogenomics и когнитивных исследований (CNCR) , неврологии Campus Амстердам (НКА), финансирование CPJdK (СВО-ALW # 822.02.013 и ENC-сеть # P3-c3) и VU университета Амстердама.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
References
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
