Этот протокол описывает внеклеточный запись потенциала действия ответов, выпущенных labellar вкусовых нейронов у дрозофилы.
Периферийное вкус реакция насекомых может быть мощно исследованы с электрофизиологических методов. Описанный здесь метод позволяет исследователю измерять вкусовые ответов непосредственно и количественно, отражая сенсорной информации, что насекомое нервная система получает от вкусовых раздражителей в окружающей среде. Этот протокол описывает все основные этапы выполнения этой техники. Критические шаги в сборке в электрофизиологии буровой установки, такие как выделение необходимого оборудования и подходящей среды для записи, очерчены. Мы также описать, как для подготовки к записи путем внесения соответствующих справочных и записи электроды, и tastant решения. Мы подробно описать метод, используемый для приготовления насекомое путем вставки стекла электрода в лету, чтобы обездвижить хоботок. Мы покажем, следы электрических импульсов, выпущенных вкусовых нейронов в ответ на сахар и горькой соединения. Аспекты протокола являются тechnically сложным, и мы включают широкий описание некоторых общих технических проблем, которые могут возникнуть, например, отсутствия сигнала или чрезмерного шума в системе, и потенциальных решений. Метод имеет ограничения, такие как неспособность доставить временно сложные стимулы, наблюдать фон обжига непосредственно перед стимул доставки, или использовать нерастворимые в воде вкусовые соединения удобно. Несмотря на эти ограничения, этот метод (в том числе небольшими вариациями упомянутых в протоколе) является стандартным, широко распространенная операция для записи Drosophila нейронные ответы на вкус соединений.
Чувство вкуса позволяет насекомое, чтобы обнаружить широкий спектр растворимых химикатов и играет важную роль в принятии питательного вещества, или отказ от вредных или токсичных один. Вкус также полагают, играет роль в выборе партнера, через обнаружение феромонов 1-5. Эти важные и разнообразные функции сделали насекомое вкус система убедительным цель расследования, как сенсорные системы перевести экологические сигналы в соответствующие поведенческие выходов.
Основной единицей MELANOGASTER вкус системе Drosophila это вкус волосы, или сенсиллы. Молекулы введите сенсиллы через поры на ее наконечника 2,6. Сенсиллы находятся на labellum, ног, края крыла и глотки 6. На labellum, количество и расположение сенсилл стереотипно. Есть три морфологические классы сенсилл на основе длины: длинные (L), промежуточный (Я) и короткие (S ) Сенсилл 7,8. Каждый сенсиллы содержит либо два (I типа) или четыре (L-и S-тип) нейроны вкусовые рецепторов (GRNs) 9. Различные GRNs реагировать на различные категории вкусовых раздражителей: горький, сахар, соль и осмолярность 7,10 и выразить различные подмножества вкусовых рецепторов 8,11-13. Только я и S-типа сенсиллы содержат горькие проблематику GRNs 8,10. Проект GRNs к subesophageal ганглия (SOG) и их активации вкусовых молекул передается с более высокой центральной нервной системы для декодирования, в результате чего поведенческой реакции 6. Относительно небольшое число нейронов и податливость к молекулярному и поведенческого анализа делают вкус система дрозофилы отличная модель для исследования вкусовых систем в целом. Относительная легкость, с которой система может управляться с помощью генетической мутации или системы экспрессии GAL4-UAS также служит в качестве ценного инструмента 14,15.
ontent "> Поскольку эти сенсиллы выступают из поверхности labellum, они делают отличные цели для электрофизиологических. стрельба из GRNs можно контролировать с помощью внеклеточной записи. Исторически сложилось, что способ записи боковой стенки, в которой используется стеклянный электрод, вставленный в сенсиллы записывать нейронную активность, 26 был использован. Однако этот способ технически сложно выполнить, и трудно записать надолго от каждого препарата. Способ зонд-записи, который измеряет реакцию нейронов с электродом, который одновременно обеспечивает tastant, с тех пор стала методом выбора 9,16. Она была использована для исследования вкусовой системы дрозофилы 8,10,17,18 а также ряд других видов насекомых 19-23. Он имеет значительно способствовало развитие усилителя tastePROBE, который преодолел один из главных недостатков метода зонд-записи, компенсируябольшой разности потенциалов между электродом и насекомых сенсиллы, позволяя потенциалы GRN действий должны быть записаны без чрезмерного усиления или фильтрации 24. Другим важным событием стало использование tricholine цитрата в качестве записывающего электролита 25. TCC подавляет ответы от осмолярности чувствительных GRN и не стимулирует чувствительные к соли GRN, что делает ответов, сгенерированные горьких и сахара Tastants гораздо легче анализировать 25.Здесь мы опишем, как наконечник запись Drosophila labellar сенсилл в настоящее время осуществляется в лаборатории Карлсон. Этот протокол будет объяснить, как установить подходящую электрофизиологии Рог, как подготовить муху, и как выполнить вкусовые записи. Мы также представляем некоторые репрезентативные данные, полученные записи с подмножеств Drosophila сенсилл, а также некоторых общих вопросов и потенциальных решений, которые могут возникнуть при использовании этоготехника.
Labellar сенсиллы различаются по легкости регистрации из-за различий в морфологии и анатомической организации. Иногда сенсиллы не реагировать на любые Tastants, даже тот, который, как известно, вызывают положительную реакцию. Частота, с которой это происходит, зависит от типа сенсиллы. L сенсил…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана НРСА predoctoral гранта 1F31DC012985 (в РД) и за счет грантов НИЗ в JC
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Linnea Вайс за полезные замечания по рукописи, доктор Райан Иосифа за помощью составления фигур, и д-р Фредерик Марион-Опрос для полезной технических консультаций. Мы также хотели бы отметить полезные комментарии четырех авторам.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |