La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

ÉTICA DE MOTIVOS Se procesaron muestras humanas y animales siguiendo las directrices del Ministerio de Salud de Italia, la ley 116/92 y la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades 86/609/CEE. 1. Monocitos culturas celulares Cultura humanos células THP-1 en matraces T-75 que contenían medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero humano, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C en 5% de CO 2. Culturas Dividir cuando confluente (cada 3-5 días). 2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de Buffy Coats Antes de iniciar el protocolo de aislamiento, preparar una solución de tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), la adición de 5 ml de BSA de la solución a 95 ml de disolución tampón de enjuague (1: 20 de dilución). Desgasificar el búfer y mantenerlo frío (2-8° C). IMPORTANTE: Si no se desgasificar el tampón puede resultar en menos de óptima resultados porque las burbujas pueden bloquear la columna de la aislamiento (véase el paso 3.2). Nota: Anticoagulante fórmula-A citrato dextrosa (ACD-A) o citrato fosfato dextrosa (CPD) se puede utilizar alternativamente. Por el contrario, otras proteínas de albúmina o sueros de otras especies pueden sustituir de BSA. No use tampones que contienen Ca 2 + o Mg 2 +. Obtener buffy abrigos de donantes sanos (edad 20-60 años). Preparar los tubos de 50 ml cónicos para la densidad de centrifugación en gradiente. Determinar el número de tubos requeridos para el procesamiento de la sangre (cada tubo puede procesar 35 ml de sangre diluida) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque a cada tubo de vacío. Diluir 8 ml de sangre con 24 ml de solución de PBS / BSA / EDTA (1:04 dilución). Capa cuidadosamente la solución diluida en la parte superior de Ficoll-Paque (densidad = 1,077 g / ml) en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezclela sangre y de Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Para evitar la mezcla de la sangre y de Ficoll-Paque, mantenga el tubo en un ángulo de 45 ° y la capa de la mezcla de la sangre lentamente. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. Las células mononucleares (MNC) permanecerán en la interfase de plasma de Ficoll-Paque, mientras que los granulocitos y los eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad en la presión osmótica de Ficoll-Paque. Transferencia de las células en interfase (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) a un nuevo tubo de 50 ml llena con PBS / BSA / EDTA y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Lavar la pella dos veces con PBS / BSA / EDTA para eliminar las plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Cultivar las células en RPMI-1640 completo con un 10% de suero humano y antibióticos o proceder a la purificación de monocitos. 3. Purificación de los monocitos primaria a partir de PBMCs Aislar los monocitos de PBMC por separación de perlas magnéticas usando Humun kit de aislamiento de monocitos Pan: Pasar las células a través de una malla de 30 micras de nylon (filtros separación previa, 30 m) para eliminar los posibles grupos de células. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar el sobrenadante por completo. Sedimento celular Resuspender en 30 l de tampón de PBS / EDTA / BSA por 10 7 células totales. Añadir 10 l FcR reactivo de bloqueo por 10 7 células totales. Añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 7 células totales. Mezclar bien e incubar durante 5 minutos a 2-8 ° C. Añadir 30 l de tampón por 10 7 células totales. Añadir 20 l de anti-biotina microperlas por 10 7 células totales. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 2-8 ° C. Resuspender hasta 10 8 células en 500 l de tampón PBS / EDTA / BSA. Separ magnéticaación De acuerdo con el número total de células, elija una columna MACS apropiado y MACS Separador (ver columna MACS hoja de datos). Colocar la columna en el campo magnético del MACS separador. Preparar la columna por lavado con la cantidad apropiada de tampón PBS / EDTA / BSA (MS columnas: 500 l; columnas LS: 3 ml). Nota: Las columnas son "parar flujo" y no se secan. Aplicar la suspensión celular en la columna. Recoger de flujo continuo que contiene células no marcadas, que representa la fracción de monocitos enriquecidos. Lavar la columna 3 veces con tampón PBS / EDTA / BSA (500 l para la EM y 3 ml de LS por lavado). Recoger las células no marcadas que atraviesan, en representación de los monocitos enriquecidos, y añadir al flujo a través de la sección 3.2.4. Nota: Lavar la columna mediante la adición de alícuotas de tampón PBS / EDTA / BSA solamente cuando el depósito columna está vacía. (Opcional) Quite la columna de laseparador y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Pipetear la memoria intermedia en la columna (MS columnas: 1 ml, esbeltas columnas LS: 5 ml). Inmediatamente enjuagar las células marcadas magnéticamente nonmonocyte empujando firmemente el émbolo en la columna. Cultura purificó monocitos en RPMI-1640 completo con 10% de suero humano y antibióticos. 4. Purificación de los monocitos primarios de sangre entera Purificar los monocitos de la sangre entera usando el kit de aislamiento de monocitos de sangre entera siguiendo las instrucciones del fabricante. 5. Internalización de nanopartículas en leucocitos de sangre y se purificaron monocitos Plate 5 x 10 5 células / ml (1 ml / pocillo) de las PBMCs aisladas o los monocitos CD14 positivos purificados en una placa de 12 pocillos. Vortex FITC-SiO2 nanopartículas de solución madre y volver a suspender en medio completo a una concentración de trabajo de 100 nM. Añadir 10 l de nanop trabajosuspensión artículo (100 nM) para las muestras tratadas para llegar a una concentración final de nanopartículas de 1 nM. Añadir el mismo volumen de medio completo para los controles sin tratar a cada pocillo. Después de 1 hora internalización recoger las muestras en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y centrifugar ellos durante 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente. Lavar el pellet con 1 ml de tampón de 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en 200 l de tampón. Las células están listas para su lectura por citometría de flujo. 6. Aislamiento de mezcla de culturas gliales primarios (Ver Bertero et al. 7) 7. Replating una mixta gliales confluentes de Cultivos Celulares Lave un frasco T-75 una vez con 10 ml de PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), a continuación, añadir 10 ml de Versene y se incuba a 37 ° C durante 5-7 min. Pipetear el sobrenadante arriba y hacia abajo varias veces con el fin de separar las células de la superficie T-75 y disolverlos agregados de células. Transferir la suspensión celular en un tubo de polipropileno de 15 ml. Se recoge una pequeña cantidad de la suspensión celular para contar las células con un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet a una concentración final de 5 x 10 5 células / ml en medio de cultivo completo de la glía. Placa 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y dejar que las células se asientan durante 2-4 horas antes del tratamiento de nanopartículas. 8. Nanopartículas Internalización en Microglia Añadir 500 l de medio de cultivo glial completa (para los controles no tratados) o 500 l de una suspensión 2x Rodamina-SiO2 de nanopartículas en medio de cultivo glial completa (para muestras tratadas) a cada pocillo. Pipetear las células para permitir la separación de las células-nonrapid la adhesión en los puntos de tiempo seleccionados y recoger en tubos de polipropileno de 2 ml. Añadir 500 lde Versene a cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C durante 5 min, a continuación, separar la fracción celular restante y recoger cada muestra con las células no adherentes correspondientes de la etapa anterior. Centrifugar las muestras durante 3 min a 300 x g a temperatura ambiente. Resuspender el sedimento en 100 l de tampón de AutoMACS. 9. La tinción con CD11b-VioBlue Añadir 10 l de VioBlue-CD11b anticuerpo humano / ratón para 100 l de suspensión celular (1:11 ratio) en tampón y se incuba 10 min a 4 ° C. Añadir 1 ml de tampón y mezclar la suspensión de células. Centrifugar cada muestra durante 3 min a 300 x g. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 a 150 l de tampón. Lea las muestras al citómetro (almacenar las muestras a 4 ° C entre los dos últimos pasos). IMPORTANTE: antes de analizar las muestras, proceda a la reparación de las señales superpuestas iLos espectros de emisión de N observó entre diferentes fluorocromos (nanopartículas o anticuerpos conjugados con fluorocromo). 10. Derrame espectral sobre la compensación Abra el cuadro de "Ajustes del instrumento" (presente en todos los programas de software del instrumento). Nota: Si está usando un instrumento diferente de la que se informa en la Tabla de materiales, por favor consulte el manual específico de instrumento para los detalles de adquisición. Adquirir muestra sin tratar (sin nanopartículas) a velocidad de fluidos de baja (si es permitido por el instrumento). Durante la adquisición, ajuste manualmente hacia adelante y la dispersión lateral (FSC y SSC, respectivamente) mediante la regulación de los canales de tensión. Nota: Modificar las escalas de los ejes del SSC y del FSC con el fin de visualizar mejor la población celular completa en la trama. Un ajuste de plantilla para cada tipo celular de interés de instrumentos puede crearse, guardarse y utilizarse para futuras adquisiciones. Abra la específicaFicha "región" en el software. Dibuje una región grande adecuada ("gate") alrededor de la población deseada. Nota: Internalización de nanopartículas induce un cambio SSC de las células. Si la puerta está demasiado estrechamente restringido alrededor de la población celular de interés, los datos adquiridos probablemente pierda parte de las células para ser detectados. Utilice dos muestras no teñidas, uno para su uso como blanco de muestra y uno para la compensación contra la tinción PI (opcional), una muestra de un solo manchado con el fluorocromo apropiado para cada canal de fluorescencia a ser compensado. Nota: Use un tubo de muestra de 1,5 ml diferente para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo para ser utilizado en el etiquetado experimento. Abra la pestaña "Compensación" en la casilla "Configuración del instrumento". Aumentar o disminuir el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de contagio es más o menos lo mismo para el pos fluorocromoitive y negativo de la población. Adquirir muestras de nanopartículas tratadas después de la compensación se ha ajustado.