القائم على الاستقطاب الانعكاس الداخلي الكامل الإسفار الميكروسكوب (pTIRFM) يتيح الكشف في الوقت الحقيقي من ديناميات غشاء الخلية. توضح هذه المقالة تنفيذ pTIRFM لدراسة إعادة غشاء إيماس خلال التنظيم. والتقنية هي تعميم لعمليات أخرى في بيولوجيا الخلية التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة التغيرات في شكل الغشاء.
للحصول على أفكار جديدة في ديناميات إيماس، ويركز مجموعتنا على تغييرات في شكل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي يجب أن تنظم على وجه التحديد خلال التحام حويصلة والبلازما الأغشية. وتتحقق هذه التغيرات السريعة والمترجمة بواسطة التفاعلات الدينامية بين الدهون والبروتينات المتخصصة التي تتحكم انحناء الغشاء. ان غياب مثل هذه التفاعلات لا نملك سوى عواقب مدمرة على الانصهار الحويصلة، ولكن مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية الأخرى التي تنطوي على السيطرة على شكل الغشاء. في السنوات الأخيرة، وقد تم تحديد هوية عدد من البروتينات مع خصائص تشكيل الغشاء. ما تبقى في عداد المفقودين هو خارطة طريق من متى وأين، وكيف أنها بمثابة الانصهار والتقدم الإفراج المحتوى.
فهمنا من الأحداث الجزيئية التي تمكن إعادة غشاء تاريخيا محدودة بسبب عدم وجود الطرق التحليلية التي تعتبر حساسة للانحناء الغشاء أو لديك القرار الزماني لتراكك التغيرات السريعة. PTIRFM يرضي كلا من هذه المعايير. نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM لتصور وتفسير السريع، والتغيرات submicron في اتجاه أغشية الخلايا أليفة الكروم خلال الحويصلة الأساسية كثيفة (DCV) الانصهار. الخلايا أليفة الكروم التي نستخدمها يتم عزل من الغدد الكظرية البقري. اتسخت الغشاء مع صبغة carbocyanine محبة للدهون، 1،1 '-dioctadecyl-3، 3،3'، 3'-tetramethylindodicarbocyanine، 4 chlorobenzenesulfonate، أو فعلت. لم intercalates في الطائرة الغشاء مع التوجه "ثابت" وبالتالي فهي حساسة لاستقطاب الحقل زائل. غشاء الخلية لم الملون هو متحمس بالتتابع مع الاستقطابات متعامدة ليزر 561 نانومتر (ف بول، ق بول). ويستخدم الليزر 488 نانومتر لتصور مكونات حويصلة والوقت لحظة الانصهار. يتم تشغيل إيماس بواسطة perfusing محليا الخلايا بمحلول بوكل إزالة إستقطاب. يتم إجراء تحليل متواجد حاليا باستخدام البرمجيات المكتوبة المخصصة لفهم كيفتغيرات كثافة الانبعاثات تتصل المسام الانصهار تمدد.
حسن تنفيذ إيماس يتطلب تغييرات متطرفة في شكل طبقة ثنائية الغشاء أن مدبرة بدقة. قبل الانصهار، الانحناء المحلية من غشاء البلازما تحت الحبيبية يحدث، في جزء منه للحد من حاجز الطاقة للتفاعل من طبقات ثنائية. في وقت لاحق، ودمج الأغشية، يتم إنشاء مناطق للانحناء عالية ويجب أن يستقر. أخيرا، يجب أن تكون عازمة الأغشية تنصهر من شكلها الأولي لتوسيع المسام والانصهار تمكين المحتوى الإفراج 1. لأن الأغشية وحده من غير المحتمل أن تخضع مثل هذه التغيرات الهائلة والمنسقة، والبروتينات ضرورية للتوسط الأحداث. ولكن كيف يتصرفون في التأثير على التغيرات في الغشاء طوبولوجيا أثناء عملية الانصهار لا يزال هناك الكثير جدا مسألة مفتوحة.
ممتازة في المختبر وجود نماذج لتصور انحناء الغشاء. استخدام السلبي وصمة عار EM، على سبيل المثال، كانت مهمة لتشكيل النماذج الجزيئية الحالي عن تصرفات الرئيسيتين الاتجار عroteins – synaptotagmin وdynamin (للمشاركات، انظر تشابمان 2 و 3 هينشو). معظم المقايسات في الوقت الحقيقي من إيماس عدم الكشف عن انحناء مباشرة. بدلا من ذلك، يتم الاستدلال على ذلك من انحناء المقايسات أن يقدم تقريرا عن حركية lumenal الإفراج البضائع 4-8 أو تغييرات في منطقة الغشاء 9-11. PTIRFM يسد الفجوة بين المجراة في الدراسات المختبرية من خلال تمكين، والقياسات في الوقت الحقيقي مباشرة من التغييرات في micromorphology الغشاء.
PTIRFM، في وضع nonimaging، كان رائدها أكسلرود وزملاؤه لقياس اتجاه NPD-PE أدرجت ضمن غشاء نموذج 12. ثم تم تطبيق هذه التقنية لتصور التغيرات الدينامية في الخلايا الحية المسمى مع الجاذبة وFM1-43 13-18. في pTIRFM، وتستخدم اثنين من الاستقطابات الحقل زائل لإثارة بالتتابع وجزءا لا يتجزأ من غشاء التحقيق: ف الاستقطاب (في الطائرة من الإصابة) وو الاستقطاب (عمودي على الطائرة من الإصابة). قبل التصوير، والتحقيق – في هذه الحالة، هل – يضاف لفترة وجيزة إلى المتوسطة خارج الخلية ويسمح ليقحم في أغشية البلازما من الخلايا لدراستها. في المناطق التي تكون فيها غشاء هو غير متوازي إلى ساترة (كما هو الحال في غشاء كشكش أو المسافة البادئة)، وهل سيكون أيضا غير متوازي. وبالتالي، فإن هذه المناطق تكون منفعل بواسطة شعاع ف بول. سوف شعاع ف بول تثير أقل فعالية في مناطق لم الغشاء الذي يتم في الغالب موازية لساترة. الصور نسبة بكسل إلى بكسل (P / S) الإبلاغ عن الانبعاثات من الإثارة متتابعة-p و ق بول من ولتسليط الضوء على وجه التحديد سوف لم مناطق تشوه الغشاء. من الناحية النظرية، وP / S نسبة الصور حساسة لحتى زوايا صغيرة من البلازما انحراف الغشاء من ساترة، مع اتساع التغييرات التي تنبأ بها المحاكاة الحاسوبية 18. P / S الصور هي أيضا مستقلة عن مسافة fluorophore من سطح ساترة و fluorophore المحليةالتركيز. وبدلا من ذلك قدمت تركيز fluorophore المحلية من خلال الصور الإبلاغ عن مجموع بكسل إلى بكسل من الانبعاثات P و 2 أضعاف الانبعاثات S (P +2 S). ف S +2 قياس حساسة للهندسة دقيقة من المسافة البادئة، مع بعض، قليلا، أو أي تغيير ممكن. هذا يمكن أن تظهر من خلال المحاكاة الحاسوبية أن التحولات نموذج لالمسام الانصهار من المبكر (أي مع العنق الضيق) إلى دولة في وقت لاحق 16،18. ف +2 S من حويصلة تنصهر تعلق على غشاء البلازما عبر العنق الضيق (ومع أكثر لم مقربة من الواجهة) ومن المتوقع أن تكون أكبر، على سبيل المثال، من أن من حويصلة تنصهر مع المسام أوسع بكثير (حيث هل هو ضمن الأكثر خفوت جزء من حقل زائل).
في هذه المقالة، ونحن نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM والاستفادة منها لدراسة، والتغيرات السريعة في الشكل المترجمة الغشاء التي تحدث أثناء الانصهار المسام تمدد. في حين طلب واحد فقط هو صراحة ديscussed، وأساليب قابلة للتعميم لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلايا الأخرى التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة إعادة الغشاء.
TIRFM القائم على الاستقطاب بالكشف، والتغيرات غير مرئي بالمجهر السريع في طوبولوجيا الغشاء. تنفيذ الأسلوب هو بسيط نسبيا، لا سيما إذا البصريات TIRF هي بالفعل في المكان. كل ما هو مطلوب هو لوحة الربع الموجة، واثنين من مكعبات استقطاب، ومصاريع لفصل ف ق بول وبول إضاءة مسارات. وعادة ما تمليه الموقف الدقيق لهذه المكونات على طاولة قرب المساحة المتوفرة.
من أجل الحصول على المعلومات الطوبوغرافية الغشاء، يجب التحقيق الفلورسنت المستخدمة يقحم مع التوجه ثابتة أو معروفة. هذه التقنية، كما هو موضح في هذه المقالة، يفترض استخدام الأصباغ carbocyanine ولكن الأصباغ الأخرى، مثل FM1-43 14، ويمكن أيضا أن تستخدم. الإجراء تلطيخ غشاء نفسها واضح ومباشر. الخلايا المستزرعة تتطلب سوى التعرض قصيرة جدا (أقل من 10 ثانية) على كمية صغيرة من الجاذبة / هل للحصول على وضع العلامات مندفعا من الغشاء. مضيفا الصبغة الزائدة يؤدي إلى تشتت الضوء المجاميع وآتش على الزجاج الذي يقلل من جودة الصورة. الإفراط في احتضان الخلايا مع صبغة يؤدي إلى صبغ الداخلي والتي لها آثار ضارة على جودة الصورة، وربما بقاء الخلية. إذا اتسخت خلية جيدا، وسوف يكون هناك تمييز واضح في الصور الانبعاثات P و S، كما هو مبين في الشكل 2A، فإن الانبعاثات P تسليط الضوء بشكل واضح مجالات الغشاء المائل التي هي ساترة (أي حواف البصمة الخلية) في حين أن كثافة الانبعاثات S سوف تكون موحدة تقريبا خلال البصمة الخلية. إذا هناك تمييز واضح بين P و S ليست واضحة، فمن الممكن أن الخلية يتم الالتزام سيئة إلى الركيزة أو غشاء الخلية ليست صحية، وعدم استخدام الخلايا للتجارب.
لدينا دراسات سابقة تصف pTIRFM تستخدم الجاذبة كما المسبار الغشاء الفلورسنت. هنا، ونحن لم تستخدم لأنها مناسبة للتجارب التصوير ثنائي اللون التي توظف GFP / pHluorin كما fluorophore الأخرى. نحن لم تثير وايال ليزر 561 نانومتر بدلا من 640 نانومتر ليزر (والذي هو أقرب إلى ذروة الإثارة به) لأن التبييض fluorophore بسرعة أكبر في 640 نانومتر. على الرغم من حقيقة أن نانومتر ليزر 561 على ذيل هل في الطيف الإثارة المنشورة، تنبعث مضان بكفاءة. ميزة أخرى من الليزر نانومتر 561 هو أنه يثير على حد سواء والجاذبة لم تمكننا من استخدام نفس الإعداد الاستقطاب لكلا تحقيقات. نلاحظ أن التوجه من fluorophore في الغشاء سوف تؤثر على تفسير طوبولوجيا الغشاء. على سبيل المثال، إذا كانت موجهة لfluorophore مع ثنائيات الاقطاب انتقالها عموديا على مستوى الغشاء (بدلا من موازية، أو موازية تقريبا، كما هو الحال مع الجاذبة أو لم)، ثم المناطق غشاء nonplanar سيتم تسليط الضوء من قبل S بسهولة أكبر بدلا من انبعاث P.
وصفناها أيضا تقنيات لعزل و electroporation الخلايا أليفة الكروم الكظرية البقري. الخلية أليفة الكروم البقري هو ق ممتازةنموذج ecretory. أنه يحتوي على مزايا كونها سهلة للحفاظ في الثقافة، استجابة لمجموعة متنوعة من secretogogues، وحيازة حويصلات إفرازية الكبيرة التي هي تصور بسهولة مع المجهر الضوئي التقليدية. للتعبير عن البروتينات الفلورية، وelectroporated الخلايا في التعليق قبل الطلاء على أطباق ثقافة المعالجة الكولاجين. في تجربتنا، وكفاءة التعبير هو أعلى من ذلك بكثير مع التثقيب الكهربائي مع أي من كا 2 + فوسفات أو الكواشف Lipofectamine. العيب من التثقيب الكهربائي هو أنه يتطلب المزيد من الخلايا (كما العديد من البقاء على قيد الحياة لا عملية) والكواشف التجارية باهظة الثمن. وذلك لأسباب غير واضحة لنا، يشتمل يست كل غشاء فعلت. بالإضافة إلى ذلك، و transfected سوى جزء صغير من الخلايا على الطبق. يمكن العثور على الخلايا التي وو transfected ملطخة بشكل جيد مع هل يكون مضيعة للوقت وهذا هو السبب تحسين الظروف لتلطيخ و electroporation تستحق الجهد.
باختصار، هذايصف rticle كيفية تنفيذ pTIRFM لرصد تشوهات غشاء السريع والمترجمة التي تحدث أثناء اندماج الحويصلات الأساسية في الخلايا أليفة الكروم كثيفة البقري. على الرغم من أن تناقش طلب واحد فقط، هي مناسبة بشكل مثالي لهذه التقنية لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى التي تنطوي على تغييرات في شكل الغشاء، بما في ذلك الإلتقام، الانقسام السيتوبلازمي، وحركية الخلية.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا البحث من قبل منحة التنمية الوطنية ساينتست (13SDG14420049) إلى AA من جمعية القلب الأميركية وأموال بدء من جامعة ولاية واين. نحن مدينون للدكتور رونالد دبليو هولز والدكتورة ماري بيتنر لتقديم المشورة بشأن التحضيرات الكظرية البقري والدكتور دانيال أكسلرود للحصول على المساعدة مع pTIRFM انشاء وتعليقات مفيدة على المخطوطة. كان يستخدم SYT-1 مع pHluorin إذن الدكتور جيرو Miesenbock (جامعة أكسفورد). تم الحصول عليها من خلال GCAMP5G Addgene. نشكر جيمس ت. تايلور، Tejeshwar راو، راشيل L. ايكمان، وPraneeth Katrapti مع مساعدة فى تحسين مختلف مراحل الإجراءات المذكورة.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |