해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다
Summary
우리의 해마 CA1 영역과 슬라이스 tetanized 영역으로부터 핵 농축 분획의 분리 이후에 장기간 상승 작용의 유도에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 활성보기 학습 및 기억의 세포 모델에 의존하는 핵 단백질 수입을 결정하기 위해 사용될 수있다.
Abstract
학습 활동에 따라 단백질 발현, 세포 내 전위 또는 인산화는 시냅스 가소성의 기본 세포 메커니즘을 이해하는 것이 필수적이다. 장기 증강 (LTP) 및 급성 해마 조각에 의한 장기적인 우울증 (주)는 널리 학습과 기억의 세포 모델로 허용됩니다. 활동에 따라 단백질 역학을 시각화하는 라이브 세포 이미징 또는 면역 조직 화학 염색 방법을 사용하여 많은 연구가있다. 그러나 이러한 방법은 하나의 신경 세포에서 형광 표지 된 단백질의 면역 세포 또는 과발현에 대한 항체의 적합성에 의존하고 있습니다. 단백질의 면역 블로는 연구 결과의 독립적 인 확인을 제공하는 다른 방법이다. 개별 tetanized 해마 조각에서 세포 내 분수의 준비의 첫 번째 제한 요소는 재료의 낮은 금액입니다. 둘째로, 처리 절차는 중요 리터 심지어 매우 짧고 작은 조작 인해슬라이스를 iving하는 특정 신호 폭포의 활성화를 유도 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 쥐의 뇌에서 급성 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 충분한 순도의 핵 농축 부분의 충분한 양을 얻기 위해 최적화 된 워크 플로우를 설명합니다. 대표적인 예로서 우리는 synapto 핵 단백질 메신저의 ERK1 / 2의 인산화 형태 야곱이 적극적으로 LTP의 유도에 따라 핵에 옭 및 CA1 신경 세포에서 핵 농축 분획에서 검출 될 수 있다는 것을 보여줍니다.
Introduction
시냅틱 N-메틸-D-아스파 테이트는 수용체 (NMDARs)는 시냅스 가소성 및 세포 생존이 신경 퇴행 및 세포 사멸을 유발할 수 extrasynaptic NMDARs 반면 시그널링의 활성화에 결정적인 역할을한다. 이러한 변화는 엄격하게 제어 / 규제 활동에 따라 유전자 발현에 의존하므로 활성화 시냅스 또는 수상 돌기 및 핵 7 사이의 지속적인 통신을 필요로한다. MAP는 ERK1 / 2 신호를 시냅스 NMDARs의 다운 스트림 이펙터하고 extrasynaptic NMDAR를 통해 시그널링 없거나 ERK1 / 2 활성 8,11에 대한 억제 효과가있는 반면, NMDAR 활성화에 의한 유전자 발현에 관여하지 않음을 키나아제.
원위 수상 돌기와 핵 사이의 셔틀로 표시되었습니다 단백질의 여러 가지가 있습니다. 이들 단백질의 대부분은 핵 이행 시그널을 포함하고 적극적으로 핵 6,9 네인과 임포 의존적으로 microtubuli을 따라 수송된다. InterestinglY, 특정 시냅스 자극에 대한 응답으로 핵이 사자의 일부는 교통. 예를 들어, 사이 클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질이 (CREB2)의 역행 수송 화학 LTD 아니라 LTP (12)에 의해 유도된다. 지역화 NMDAR 종속 시냅스 자극 장기 해마 가소성 4에서 포함되는 핵 전좌 프로세스로 CREB 조절 전사 보조 활성화 (CRTC1)를 구동한다. 그것은 최근에 단백질 메신저 야곱이 모두 후 핵 시냅스와 extrasynaptic NMDAR 활성화에 옭 및 CREB 따라 유전자 전사 5를 조절 것으로 나타났다. 신호의 시냅스 또는 extrasynaptic 원점은 야곱의 번역 후 변형에 인코딩된다. 시냅스 활동이 주 해마 문화의 핵 이후의 전위에 대한 필수입니다 위치 180 (pJacobS 180)에서 중요한 세린에서 야곱의 ERK1 / 2 의존 인산화를 유도한다. 또한, 전N CA1의 샤퍼 담보 LTP 후 핵 급성 해마 조각 pJacobS 180 옭의 뉴런하지만은 1,10 LTD. pS180 야곱은 가소성 관련 유전자의 발현 증가로 연결이 유전자 발현은 시냅스 기능에 피드백. extrasynaptic NMDARs의 활성화가 Ser180 인산화되지 않고 원인이 핵에 다른 단백질 복합체와 연관 될 수 있습니다 후 핵 옭 대조적으로, 야곱에서 'CREB는 차단'와 연접 (10)의 후퇴.
synapto 핵 단백질 메신저의 핵 수입에 출판 된 대부분의 연구는 해리의 연결을 기본 문화에서 수행되고있다. 신경 세포의 연결 및 기능이 매우 잘 보존 된 곳 따라서 이러한 연구 결과는 해마 조각을 사용하여 생리 학적 관련성 조건에서 재현 할 수 있는지 흥미로운 일이 될 것이다. 여기에서 우리는 LTP 드를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시면역 블로에 의해 단백질 메신저의 핵 전좌 매달린. 이 방법은 조 핵 분획 단백질의 활성에 의존 인산화 분석에 적합하다. 구체적으로는, 현재 프로토콜은 급성 CA1 해마 슬라이스, 유도, 및 LTP의 기록의 준비를 포함한다. 다음에, CA1 영역 현미경 자극 영역을 분리 해부된다. 우리는 결합 조 및 동료 (17)에 의해 도입 된 변경 CellLytic 핵 추출 키트에서 제공하는 핵 분리를위한 프로토콜을 수정했습니다. 최적화 과정은 세포 부종과 핵의 분리를 허용 저장성 버퍼 해부 CA1 영역의 용해를 포함한다. 세포 용해 및 핵의 형태를 현미경 검사에 의해 결정될 수있다. 핵 농축은 짧은 원심 분리 단계에 의해 달성된다. NeuN 및 NSE2 핵 또는 세포질 분획 특정 마커에 대한 항체로 면역 블 롯팅 분석을하는 것은이 방법은 고속으로 사용될 수 있음을 나타낸다재생 가능한 프로토콜은 이러한 세포 내 분수를 분리하고 단백질 인산화와 같은 매우 불안정한 번역 후 변형을 연구. 또한,이 방법은 해마 슬라이스 해부 CA1 영역으로부터 도출 작은 조직 샘플에 유리하고 해마 슬라이스에 면역을 조합하여 사용할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜에 설명 된 단계는, 해마 급성 젊은이나 성인 쥐에서 슬라이스 준비 슬라이스의 자극 영역을 유도하고 기록 LTP가 신속하게 해부하고, 활동에 따라 단백질 역학을 공부 핵 농축 분획을 준비하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이러한 접근 방식은 서로 독립적으로 사용되는 몇 가지 상이한 방법의 조합으로부터 도출한다. 우리는 워크 플로우를 최적화 LTP의 유도에 따라 단백질의 세…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
