وضع ما يصل إلى<em> في المختبر</em> نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة
Summary
كان الهدف من هذه الدراسة للتحقق من صحة استنساخ لنموذج BBB في المختبر تنطوي على الفئران مسانج شارك في ثقافة من الخلايا البطانية والخلايا النجمية. أحادي الطبقة الخلية البطانية قدم عالية ومنخفضة النفاذية طير LY. التعبير عن البروتينات TJ محددة، تم تقييم الاستجابات الوظيفية للالتهاب وظائف النقل والمستقبلات.
Abstract
حاجز الدم في الدماغ (BBB) ينظم تحديدا تدفق الجزيئية والخلوية بين الدم والأنسجة العصبية. كان هدفنا لتطوير وتميز مسانج الفئران تكرار للغاية في نموذج المختبر من BBB باستخدام المشترك الثقافات من الفئران الخلايا البطانية الدماغ الأولية (المكتب الإقليمي) والخلايا النجمية لدراسة مستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. تم عزل الخلايا النجمية عن طريق تشريح الميكانيكية التالية الهضم التربسين وجمدت في وقت لاحق شارك في الثقافة. تم عزل المكتب الإقليمي من القشور الفئران القديمة 5 أسابيع. تم تنظيف أدمغة السحايا والمادة البيضاء، وفصلها ميكانيكيا التالية الهضم الأنزيمية. بعد ذلك، تم طرد جناسة الأنسجة في ألبومين المصل البقري لفصل أجزاء السفينة من النسيج العصبي. خضع شظايا سفينة الهضم الأنزيمية الثانية إلى الخلايا البطانية خالية من المصفوفة خارج الخلية الخاصة بهم. تم جمعة المتبقية الخلايا تلويث مثل pericytesurther القضاء عليه من خلال طلاء شظايا في microvessel التي تحتوي على بوروميسين المتوسط. كانوا ثم passaged على مرشحات لاشتراكهما في الثقافة مع الخلايا النجمية نمت على الجزء السفلي من الآبار. أعرب المكتب الإقليمي مستويات عالية من مفرق ضيق (TJ) البروتينات مثل occludin، claudin-5 وZO-1 مع توطين نموذجية في حدود الخلية. وصلت إلى المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) من الدماغ الطبقات الوحيدة البطانية، مما يدل على ضيق TJS 300 أوم · 2 سم في المتوسط. كانت معاملات نفاذية البطانية (PE) لوسيفر الصفراء (لي) استنساخه للغاية بمتوسط قدره 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة. أعرب الخلايا البطانية في الدماغ التي تنظم في الطبقات الوحيدة للهروب رأس المال نقل ف بروتين سكري (P-GP)، أظهر النقل الاستقطاب من رودامين 123، ويجند لP-GP، وأظهر النقل المحددة من ترانسفيرين-CY3 وDiILDL عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. في الختام، ونحن نقدم بروتوكول للإقامة في المختبرنموذج BBB التي هي تكرار للغاية نظرا لأساليب ضمان الجودة، والتي هي مناسبة للبحث في نقل BBB والمستقبلات.
Introduction
وضعت العديد من الأدوية لعلاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) اضطرابات غير قادرين على الوصول إلى لحمة الدماغ في تركيزات ذات الصلة علاجيا. ويحمي الدماغ BBB النسيج العصبي من تذبذب تكوين البلازما، من العوامل الممرضة، ويحافظ على التوازن من لحمة الدماغ عن طريق تقييد تدفق غير محددة من الأيونات، والببتيدات والبروتينات وحتى الخلايا داخل وخارج الدماغ 1.
وبفعل الخصائص BBB والتي تحتفظ بها القرب الحميم وعبر الحديث بين الطبقة المتخصصة microvessel الدماغ الخلايا البطانية والعناصر المجاورة من حدة العصبية الدبقية والأوعية الدموية (NGVU) مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية (على نحو أدق نجمية نهاية أقدام)، وpericytes مغمد في الغشاء القاعدي الذي يتألف أساسا من نوع الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، laminin والبروتيوغليكان 2،3. Pericytes تغطية حوالي 22 – 32٪ من البطانة على المستوى الشعري وتضطلع بدور هامدور في تنظيم انتشار البطانة، الأوعية الدموية والعمليات الالتهابية. الخلايا البطانية تشكيل ورقة المستمر الذي يغطي السطح الداخلي للالشعيرات الدموية. مترابطة من قبل TJS، والتي تشكل بنية تشبه الحزام في المنطقة القمية والتي تسهم في الاستقطاب الخلية. الخلايا النجمية تنظيم خصائص BBB ومصادر من العوامل التنظيمية الهامة مثل TGF-β، GDNF، bFGF وIL-6. الخلايا النجمية نقص في GFAP مع وظيفة غير مكتملة ليست قادرة على تنظيم خصائص BBB 4. الخلايا العصبية لا يشاركون مباشرة هيكليا في تشكيل BBB ولكن أيضا تنظيم جوانب هامة من البروتين التعبير وظائف BBB 5.
من أجل مواصلة دراسة بنية، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من BBB، وقد وضعت في المختبر نماذج من BBB كأدوات للبحث. وقد تم استخراج الخلايا البطانية الدماغ من الأنواع المختلفة لتنفيذ نماذج في المختبر BBB مقرهاعلى انخفاض مرور الثقافات الأولية من الأبقار 6،7، 8،9 الخنازير، الفئران 10،11،12، والماوس 13 وأيضا الإنسان 14،15. ومن المعروف أن هذه النماذج لمحاكاة في الجسم الحي BBB، ولا سيما عندما شارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية من الفئران أو الفئران و / أو pericytes 16،12، و / أو السلف المستمدة من الخلايا النجمية العصبية 17 و / أو الخلايا العصبية 18. غالبا ما تنتج نماذج "في مختبر" من القوارض لأنها تسمح في المختبر / في التجارب المجراة ومقارنات و / أو دراسة الخلايا البطانية الدماغ المنتجة من النماذج المعدلة وراثيا 19.
وضعت حديثا في نماذج BBB المختبر كما تم تصميمها للمساعدة في التنبؤ امتصاص الدماغ من المرشحين المحتملين للمخدرات CNS قبل في الجسم الحي اختبار 15،20،21،3،6،22،11،23. وعادة ما تستخدم في المختبر نماذج BBB للمقارنة نقل المخدرات مع: ط) المعروف تغلغل في الجهاز العصبي المركزي أو مع لترآه نفاذية عبر BBB وليس له آثار المركزية، والثاني) الظاهر بي من نفس العقاقير قياس في النماذج الحيوانية من نفس النوع. الأدوية التي تمر بسهولة BBB هي في معظمها محبة للدهون وعبور أغشية الخلايا البطانية الدماغ عن طريق بوساطة الدهون نشرها مجانا (الكافيين، كاربامازيبين، الخ). المخدرات تنقل سلبا مثل الديجوكسين، فيراباميل أو السيكلوسبورين A تنبثق بنشاط الدماغ البطانية نقل هروب رأس المال مثل P-GP. ومع ذلك، فإن العديد من الجزيئات العلاجية المطورة حديثا هي المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، مثل البروتينات المؤتلف، الرناوات siRNAs أو الاجسام المضادة. معظمهم لا عبور BBB بسبب: أ) عدم وجود نقل معينة، والثاني) طبقة معبأة بإحكام من الخلايا البطانية التي تمنع الجزيئات عالية الوزن الجزيئي من تمر مرور paracellular. مع هذه الحدود، وقد تم تنفيذ استراتيجيات "حصان طروادة" باستخدام ناقلات (الأجسام المضادة، الببتيدات) ضد مستقبلات المعروفة في BBB، والمشاركة طن مستقبلات بوساطة النقل أو transcytosis (RMT)، مثل ترانسفيرين (TF) مستقبلات (TFR)، ومستقبلات الأنسولين (IR)، أو أعضاء من مستقبلات LDL (LDLR) المتعلقة بالأسرة مستقبلات (LDLR، LRP1). تم العثور على هذه المستقبلات على الشعيرات الدموية في الدماغ ومعزولة في BBB في الجسم الحي 24،25. ملامح النسخي لهذه المستقبلات، ولا سيما تلك الأسرة LDLR، تم تحليل ومقارنة بين الخلايا البطانية الدماغ والخلايا البطانية الدماغ شارك في تربيتها مع الخلايا النجمية أو في الشعيرات الدموية في الدماغ مباشرة بعد استخراجها من الدماغ 26. Pardridge 24 فتح المجال مع الأجسام المضادة OX-26 ضد مستقبلات ترانسفيرين (TFR)، تليها أجسام مضادة ضد مستقبلات الانسولين والانسولين مستقبلات عامل النمو 27،28. مع هذه النواقل مقرها الأجسام المضادة، وقد وضعت تقنيات ArmaGen لBBB الجزيئية طروادة الحصان منصة تكنولوجيا لتوصيل الأدوية، بما في ذلك البروتينات، عبر BBB 29. الالأدب غنية في التعبير LRP1 بيانات تظهر في الخلايا البطانية الدماغ ودورها بوصفها قوية التقامي / زبال مستقبلات. اقترح تحليل لطخة غربية أن يتم التعبير عن LRP1 في الكسور المخصب في الشعيرات الدموية في الدماغ والمخ في الفئران الخلايا البطانية الشعرية 30. شركات مثل Angiochem الهدف LRP1 مع ناقلات الببتيد المستمدة من أبروتينين التي تعزز كفاءة تدفق المخدرات عبر BBB 31. ومع ذلك، وتشارك أيضا في LRP1 النقل النشط من Aβ وهروب رأس المال في / تصريح من الدماغ لحمة الدم 32. تنطوي هذه البيانات LRP1 في نقل ثنائي الاتجاه عبر BBB اعتمادا على بروابط لها. biOasis تطور التكنولوجيا تجاوز باستخدام melanotransferrin البروتين لنقل البيولوجية مثل الانزيمات الليزوزومية والأجسام المضادة عبر BBB-33 بينما VECT حورس تطور ناقلات الببتيد التي تستهدف LDLR 34. هناك بيانات تشير إلى أن الدوريات طويلة المدى وLDLR يمكن استخدامها لنقل فرقجزيئات erent مثل الانزيمات الليزوزومية 35،36 المجمعات أو جسيمات متناهية الصغر عبر BBB 37.
لدينا مجال الاهتمام هو تسليم المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي باستخدام جزيئات النواقل وvectorized-المرشحين المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي. على وجه الخصوص، تسليم المخدرات عبر BBB لابد من النظر في سياق neuroinflammation، وهي العملية التي قد تختلف في مداها، ولكن ربما كان هذا هو مشترك بين جميع الآفات والأمراض الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التهاب الدماغ، والتصلب المتعدد، ومرض الزهايمر الخ Neuroinflammation ويرتبط مع التهاب BBB وربما مع تغييرات في وظائف الأعضاء ونفاذية BBB معتبرا أن paracellular والنقل العابر للخلايا يمكن تضخيمها في الحالات المرضية 38،39،40،41،42،43. على سبيل المثال، TNF-α، القرص، والسيتوكينات الأخرى تعدل الالتهاب، وأظهرت التجارب في المختبر مع نماذج BBB أنها يمكن أن يغير خصائص paracellular من اله البطانية أحادي الطبقة خلية 38،39،40 والتي TNF-α يؤدي أيضا إلى زيادة في النقل العابر للخلايا من LDL 41، 42 holotransferrin واللاكتوفيرين 43.
كان هدفنا لتطوير وتميز على الوجه الأمثل، وتكرار للغاية مسانج الفئران BBB النموذج باستخدام المشترك الثقافات من الخلايا البطانية الدماغ الأولية والخلايا النجمية. كنا فئران ويستار القديمة 5 أسبوع وحديثي الولادة لإنتاج الخلايا البطانية الدماغ والإنتاج نجمية على التوالي. كان واحدا تحديا لوضع بروتوكول يسمح للإنتاج "استنساخه الأسبوعية" نماذج BBB. للوصول إلى هذا الهدف، تم تنفيذ كل خطوة من بروتوكول الإنتاج في أيام محددة من الأسبوع، بدءا من إنتاج microvessel المخ يوم الأربعاء من الأسبوع الأول. أجريت تشريح كل أسبوع تقريبا خلال السنوات ال 3 الماضية. لزيادة تحسين استنساخ الثقافات، تم إنشاء نظام لضمان الجودة. جميع reagenوالمشار إليه البحوث والمواد الكيميائية في قاعدة بيانات (تاريخ الدخول، الأوراق المالية، ومدة الصلاحية، وغيرها).
وقد تميزت نموذج التالية عددا من المعايير، مثل المنظمة الخلايا البطانية والنقاء، طير، LY النفاذية، ردا على وكلاء الموالية للالتهابات، والتعبير النوعي والكمي للبروتينات TJ، وظائف من الناقلين هروب رأس المال مثل P-GP، ومستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية مثل معدل الخصوبة الاجمالي أو LDLR.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا تنفيذ بروتوكول استنساخه الأسبوعية لعزل وطلاء من microvessels الدماغ، وبعد تنقية وثقافة المكتب الإقليمي وكذلك إعداد المشترك الثقافات مع الخلايا النجمية الفئران الأولية لإنشاء نموذج BBB في المختبر مع خصائص مميزة BBB.
إنشاء بنجاح موحدة في الثقافات BBB المختبر يتطلب الظروف المثلى في خطوات متعاقبة متعددة من العملية. كان (أ) نموذج الأمثل للحصول على أقل نفاذية paracellular، الذي لا يزال "الكأس المقدسة" في المختبر نماذج BBB، و (ب) التحقق من صحة لهروب رأس المال وآليات RMT.
إنتاج وتنقية وانتشار المكتب الإقليمي
التحدي الأكبر عندما زراعة المكتب الإقليمي هو لتحقيق التكاثر بين الثقافات المختلفة. توحيد بروتوكول يتطلب أدوات ذات جودة عالية لديسقسم والكواشف ذات جودة عالية واحترام تواريخ انتهاء الصلاحية كاشف. يحتاج المجرب لتكون ماهرة في تشريح الصغرى تحت stereomicroscope لإزالة السريع لالسحايا والأوعية كبيرة من سطح القشرة. مرة واحدة يتم عزل العقول وفصلها ميكانيكيا، واحدة من التحديات الرئيسية هي الهضم الأنزيمي الأمثل للmicrovessels الدماغ معزولة حديثا. نوع ونوعية الانزيمات تستخدم أمر بالغ الأهمية. تم استخدام مزيج من collagenases النوع الأول والثاني وdispase في تركيز عال مع تقلب منخفض بين دفعات. المهم أيضا هي مدة الهضم الأنزيمي والنسبة بين الوزن تركيز انزيم / الأنسجة / حجم الهضم. تم الحصول على أفضل عائد الإنتاج microvessel الدماغ مع ما يعادل قشرات الدماغ من 1 في 1 مل من collagenases / dispase خلط في 60 ميكروغرام / مل على حد سواء أثناء الهضم، على التوالي 30 دقيقة و 1 ساعة.
بالغ الأهمية أيضا هو القضاء على تلوث الخليةق (الخلايا النجمية وأساسا pericytes). تتكاثر هذه الخلايا بمعدل أعلى من الخلايا البطانية وليس إنشاء منعطفات ضيقة مع هذا الأخير، وبالتالي منع إقامة أحادي الطبقة خلية متجانسة مع حسن paracellular التقييد. بالنظر إلى أن الخلايا البطانية الدماغ تعبير عن مستويات أعلى بكثير من المضخات هروب رأس المال، وخاصة P-GP، مقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة في microvessels، فإنها تحمل أفضل التركيزات السامة إلا من ف سباق الجائزة الكبرى يجند المخدرات، في حين يتم التخلص من الخلايا غير البطانية. وأعقب العلاج بوروميسين في 4 ميكروغرام / مل لأول يومين قبل يومين عند 2 ميكروغرام / مل جيدة للحصول على نقاء الخلايا البطانية. يمكن هذا الاختيار أيضا لصالح الخلايا البطانية الشعرية مقابل تلك من الأوردة، والشرايين قبل شعري أو microvessels أكبر، وتؤدي إلى تشديد الطبقات الوحيدة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الفقراء مصل بقري المستمدة من البلازما أمر حتمي للحصول على ثقافات نقية من الخلايا البطانية 47،48. البلازما وديرمصل IVED يفتقر المستمدة من الصفائح الدموية عامل النمو (PDGF)، وهو مولد للتفتل لالليفية، لخلايا العضلات الملساء وبالتالي لpericytes.
لاحظنا أن العلاج من البلاستيك والفلاتر مع مزيج من نوع الكولاجين الرابع من الفئران والإنسان فبرونيكتين تعطي ميزة كبيرة، مع زيادة بنسبة 2 أضعاف العائد من انتشار بالمقارنة مع نوع الكولاجين أنا أوصى تقليديا من ذيل فأر. وتقدم العظة هامة لتكاثر الخلايا عن طريق المصفوفة خارج الخلية مثل إنتغرين وعامل النمو (bFGF) التنشيط 49. وقد وصفت تركيز العازلة والرقم الهيدروجيني للثقافة وسائل الإعلام للتأثير إيجابا على ضيق paracellular 50 و لاحظنا استنساخ أفضل بين الثقافات مع إضافة العازلة HEPES في 5 ملم.
التفريق بين المكتب الإقليمي: إنشاء المشارك الثقافة على إدراج الفلاتر
بمجرد ب الخلايا البطانية الدماغالتابعين تنقيته وتكاثرت لمدة 6 أيام، ويمكن مطلي على المرشحات. الطلاء الخلية في عالية الكثافة أمر بالغ الأهمية للحصول على أحادي الطبقة الكمال. وكان من كثافة البذر من 160×10 3 خلايا في 12 لوحة جيدا الفلاتر اللازمة والكافية للحصول على متكدسة أحادي الطبقة 24 ساعة بعد البذر. ومع ذلك، عزل الخلايا البطانية الشعرية الدماغ الأولية من بيئتهم مفارقة في بناء BBB في المختبر النموذجي كما أنه من المعروف أن الخلايا الأولية، والخلايا البطانية الشعرية وخاصة الدماغ، وينظم بقوة بيئتهم والعوامل التي تنتجها الاستقرائي مختلف أنواع الخلايا المحيطة. الخلايا البطانية الشعرية الدماغ مثقف وحده بسرعة إزالة التفريق وتفقد بعض علامات محددة البطانية الدماغ. وبالتالي، الخلايا البطانية الأولية ينبغي أن تستخدم في انخفاض مرور (P1) وإعادة توصيل، على الأقل جزئيا، مع بيئتهم من خلال ثقافة مشتركة مع الخلايا النجمية أو متوسطة مشروطة النجمية 47،51. هذا حاصلوتشارك ينطبق على تمايز نجمية كما الخلايا البطانية الدماغ والخلايا النجمية في اتجاهين الاستقراء. زراعة الخلايا النجمية مع المكتب الإقليمي أدى إلى تحريض قوية من TJ interendothelial 52،23. الآليات الجزيئية إعادة الاستقراء، لا تزال مجهولة إلى حد كبير، والبحث جار في العديد من المختبرات لتحديد العوامل المحددة التي يفرزها تحوير الخلايا النجمية، والتي يمكن أن تعزز الأمثل تمايز الخلايا البطانية 53،54. وقد تبين أن العوامل التي يفرزها الدماغ بما في ذلك الخلايا البطانية عامل اللوكيميا المثبطة (LIF) للحث على تمايز نجمي 55،56. قبل إنشاء ثقافة مشتركة، وتعرضوا لتمايز الخلايا النجمية المتوسطة التي تحتوي على مستقبلات ناهض الهيدروكورتيزون جلايكورتيكود، وشارك في الثقافة مكيفة المتوسط. ومن المعروف الهيدروكورتيزون لتحسين ضيق من الخلايا البطانية في الدماغ ويستخدم في نماذج BBB خاصة من الفئران 57 و الماوس 58،59 الخلايا البطانية. وميدي مكيفةيتم جمع أم من المقصورة السفلي من الخلية / نجمية نظام التعاون ثقافة البطانية بعد 3 أيام، وتجميدها لاستخدامها لاحقا. استخدام المتوسطة شارك في الثقافة مكيفة تخفيض وقت تمايز الخلايا البطانية إلى 3 أيام مع الأمثل نفاذية paracellular لمدة 2 ايام اخرى وتحسنت أيضا استنساخ بين الثقافات.
وعموما، فإن البروتوكول وصفنا تعطي طير استنساخه أكثر من 300 أوم · 2 سم ومتوسط معامل نفاذية paracellular بي (لي) 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة، على غرار أفضل خلية مقرها النماذج الأولية BBB 22، 12. البروتوكول وصفنا في مخطوطة موجودة مع التشكيل المقترح للmicrovessel الأنزيمية الهضم يمكن أن تمتد إلى الخلايا البطانية من الفئران الحبل الشوكي و60 من الفئران الدماغ.
توصيف الجزيئية والوظيفية
بالإضافةلTJ الاستقراء، النجمية تسهم أيضا في التعبير عن النقل هروب رأس المال مثل P-GP في الخلايا البطانية الدماغ 61. وتبين لنا الواقع تعبير عن هروب رأس المال نقل P-GP في النموذج BBB ونحن لشرح قطبية ف سباق الجائزة الكبرى مضخة هروب رأس المال باستخدام نهج التعريب والكيمياء الحيوية، والنشاط P-GP باستخدام مقايسة وظيفية. تم الكشف عن GLT-1 التعبير في جزء من الغشاء القاعدي microvessels ولكن لم يتم الكشف في المكتب الإقليمي مثقف. نحن نفترض أن GLT-1 وينظم المكتب الإقليمي لأسفل في الثقافة لدينا مقارنة مع الظروف في الجسم الحي، وبالتالي لا يمكن كشفها بواسطة تحليل لطخة غربية. الغلوتامات الزائدة هي أعصاب والحية، GLT-1 هي المسؤولة عن الغلوتامات هروب رأس المال من المقصورة القاعدية (حمة) إلى حجرة القمي (الدورة الدموية). في الثقافات نجمية، لا يزال GLT-1 التعبير منخفضة للغاية والناجم عن إضافة الغلوتامات في المتوسط 62،63.
نحن أيضا أسيوطIRM التعبير عن نقل تدفق في الغشاء القمي مثل LRP1، LDLR ومعدل الخصوبة الاجمالي. وقد تجلى ظائف معدل الخصوبة الاجمالي وLDLR مع ملزمة والنقل تجارب TF-CY3 وDiLDL من اللمعية إلى الجانب مجافي اللمعة من أحادي الطبقة كما هو موضح سابقا مع الأبقار في المختبر BBB نموذج 64. ومن المثير للاهتمام، وقد تبين أن شرط الدهون من الخلايا النجمية يزيد من التعبير عن LDLR على الخلايا البطانية الشعرية الدماغ 65،66 مزيد من التأكيد على الحديث المتبادل بين الفسيولوجية النجمية والخلايا البطانية في الدماغ، بما في ذلك في المختبر. لقد اخترنا لتجسيد النقل مع مثل هذه الأصباغ الفلورية كما CY3 والجاذبة بالنظر إلى أن تحليل spectrofluorimetric هو متاح في معظم المختبرات، ويمكن أن تكون مفيدة للتحقق من صحة في المختبر نماذج BBB. ومع ذلك، الكمي لمضان هو أبعد ما يكون أقل حساسية من النشاط الإشعاعي ويتطلب زيادة في عدد من التجارب للحصول على بيانات هامة. من الناحية المثالية، وفريق العمل وLDL وعادة ما تكون رديولبلد (اليود 125) لمثل هذه التجارب ملزمة / الامتصاص والنقل.
وتبين لنا أيضا أن الخلايا البطانية أحادي الطبقة المتباينة التي تم الحصول عليها مع البروتوكول المقترح يستجيب لالتهاب الناجم عن TNF-α، كما يتضح من الإفراج CCL2 وBBB الافتتاح. CCL2 تشارك (MCP-1) وCCR2 مستقبله في أمراض الجهاز العصبي المركزي مثل التصلب المتعدد، والتهاب الدماغ والنخاع المناعة الذاتية التجريبية (EAE) 67، 68 CNS الصدمات والمعروفة باسم الوسطاء للهجرة الكريات البيض في الجهاز العصبي المركزي في ظل ظروف neuroinflammatory 69،70. مع بروتوكول اختبار، لا يمكننا أن نستنتج على إفراز الاستقطاب من CCL2 لأن BBB الافتتاح يسمح للتركيز CCL2 للتوازن بين كلا العليا (القمي) وانخفاض (القاعدية) المقصورات. وبالتالي، فإننا نقلل بوضوح مقدار CCL2 التي تنتجها المكتب الإقليمي في المقصورة القمي في 24 ساعة (الشكل 5A).
<p class="jove_content"> نظرة عامة عامة والقيود من BBB في المختبر نماذج: أنا ن فيفو مقابل في المختبر والقوارض مقابل مقارنات الإنسانالعديد من الأدوية CNS الواعدة التي أثبتت فعاليتها في BBB مرور في المختبر فشلت في التجارب السريرية بسبب عدم القدرة على التنبؤ من نماذج في المختبر BBB غالبا ما تستند على خلايا معزولة عن الأنواع الأخرى من الإنسان. إلى حد علمنا، في المختبر نماذج BBB هي على الأرجح أكثر التنبؤية عندما يتعلق الأمر بدراسة الجوانب الميكانيكية للشبكات البروتين، ونقل الإشارة، ونقل المستقبلات. كل آلية، المسار أو الهدف لدراستها في المختبر لابد تتميز عن التنظيم من خلال العظة البيئية التكميلية (أنواع الخلايا الأخرى، والمواد الكيميائية والبروتينات)، والجمع بين لفي الدراسات الموقعية مع الأنواع الحيوانية نفس، وعندما يكون ذلك ممكنا، مع microvessels والخلايا البطانية المعزولة من البشر، مع القيود والحذر أثار أدناه.
في المختبر نماذج BBB يجب أن ينظر إليها على أنها أنظمة مستقلة، معزولة عن تنظيم الجسم، ولكن لا يزال هبوا الرئيسية في الجسم الحي خصائص وإمكانات التنظيم من قبل العظة البيئية. لا "مثالية" تم اقتراح نموذج في المختبر BBB بعد 71،72،73 لأن الطبقات الوحيدة الخلية البطانية تفتقر إلى عدد من المكونات الهامة للوحدة الوعائية العصبية الدبقية (NGVU) ويتم عزل من الدم وتنظيم الجسم. عدم وجود pericytes 74،16 أو 17،18 أو الخلايا العصبية المكونة مختلفة من المصفوفة خارج الخلية المستخدمة لطلاء من البلاستيك أو مستنبت والمصل المستخدمة في نمو الخلايا في الأكثر شيوعا و"أسهل تقدم" في المختبر نماذج BBB يعتمد على البطانية خلايا متباينة مع الخلايا النجمية قد تعدل بروتين تعبير طن مقارنة مع الوضع في الجسم الحي 75. هذه النماذج قد أعرب العديد من الناقلين عرضها في الجسم الحي، ولكن ليس كل شيء. في بعض الحالات، وتم التحقق من المعلمات النقل الأولى في microvessels معزولة (الأقرب إلى الوضع في الجسم الحي)، وبعد ذلك درس في أنظمة زراعة الخلايا 76،61.
وقد سمح البحوث البيولوجيا الجزيئية توصيف الجينات والبروتينات التعبير في microvessels معزولة ومنخفضة مرور البطانية مزارع الخلايا من نفس النوع، وبين الأنواع المختلفة، في معظم الأحيان من الحيوانات الصغيرة مثل القوارض (الفئران والجرذان) أو من البقر والخنازير في بالمقارنة مع البشر 77،78،75،15. وأظهرت المقارنة بين Transcriptomic في الجسم الحي والخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ المختبر العديد من النصوص الجينات التي تم وأعرب تفاضلي في معظم الأحيان downregulated بشكل ملحوظ في المختبر. النصوص ترميز نقل تدفق مثل معدل الخصوبة الاجمالي والعلاقات العامةوdownregulated oteins المتورطين في الاتجار حويصلة أساسا في الخلايا البطانية مثقف الدماغ، مما يشير إلى انخفاض عام في الإلتقام والنقل الحويصلي في مثل هذه الخلايا. التلاعب الثقافة من حيث النقاء (العلاج بوروميسين) والعلاج مع الهيدروكورتيزون قد يساعد على استعادة أكثر "في الجسم الحي مثل" التعبير الجيني الشخصي 77. كشفت الدراسات Transcriptomic أيضا اختلافات هامة بين الأنواع التي تزيد من تعقيد التوقعات على امتصاص الدواء في البشر على أساس القوارض في المختبر نماذج BBB 75. وقد وصفت في المختبر نماذج BBB تنطوي الثقافة المشارك للخلايا النجمية والبطانية الإنسان 15. على الرغم من أن ذات الصلة، وهذه النماذج هي أكثر صعوبة لتنفيذ على أساس منتظم لأنها تتطلب تنظيم الوصول إلى الأنسجة البشرية بعد الوفاة، وهناك عدم تجانس في جودة / خصائص الخلايا البطانية الدماغ البشري اعتمادا على العمر والأمراض، وربما الطبية المعاملهر من الجهات المانحة. الجهود يجب أن تبذل لتطوير نماذج جديدة في المختبر التي تتكاثر بشكل أفضل الفسيولوجية، التشريحية والخصائص الوظيفية لفي الجسم الحي BBB. الثقافات، تشترك الأنواع الثلاثة خلية مقيدة للغاية، ويبدو من الصعب تنفيذ بشكل روتيني. حتى الآن، والأكثر تعقيدا في المختبر نماذج BBB هي ديناميكية في المختبر نماذج (DIV-BBB) والتي تشمل تنظيم مثل السفينة مع الخلايا النجمية وتشمل تدفق المتوسطة الذي يحاكي تدفق الدم 75،79،80،81،82، 83،84،85. عندما تتعرض الخلايا البطانية الدماغي إلى التدفق، وإجهاد القص ولدت ينشط mechanotransducers على سطح الخلية، والتي تعدل التعبير عن الجينات المختلفة المشاركة في فسيولوجيا الخلية البطانية مثل انقسام الخلايا، والتمايز، والهجرة وموت الخلايا المبرمج 80. في الجسم الحي، إجهاد القص الناتجة عن تدفق الدم هي المسؤولة عن اعتقال الإنقسامية في الاتصال الخليوي، والذي يسمح بإنشاءأحادي الطبقة الخلايا البطانية في الأوعية الدموية 80. وأظهر التحليل الجيني والبروتين من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري العادي تأثير إجهاد القص في BBB البطانية علم وظائف الأعضاء 84. إجهاد القص هو المسؤول عن بقاء الخلية، وعلى درجة أعلى من التصاق الخلايا البطانية، هروب رأس المال مضخة الاستقراء والاستقطاب أفضل للنقل 75، وتنظيم استقلاب الجلوكوز 75،86، والأكسدة بوساطة الإنزيمات CYP450 75 وتنظيم نفاذية paracellular عن طريق زيادة التعبير من الجينات ترميز لعناصر صلي بين الخلايا مثل occludin وZO-1 87،75،80 وبالتالي ارتفاع طير حوالي 1،500 – 2،000 أوم · سم 2، والأقرب إلى المعروفة في الجسم الحي المعلمات 79،80
في صناعة التكنولوجيا الحيوية والمستحضرات الصيدلانية، بالتحري الروتيني للأدوية أو حتى عالية الإنتاجية الفرز (HTS) والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات، أدتلتطوير خطوط مختلفة من الخلايا لاستخدامها في استبدال ثقافة الأولية من الخلايا البطانية الدماغي التي لا تزال أكثر صعوبة لانشاء روتيني. في معظم الحالات، و transduced الثقافات الأولية من الخلايا البطانية الدماغي مع الجينات تخليد (SV40 أو التورام الفيروس كبيرة T-مستضد أو اتش E1A)، إما عن طريق ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد أو عن طريق العدوى باستخدام ناقلات فيروسات 88،89،75. وقد وضعت العديد من خطوط الخلايا البطانية المنشأ الدماغي مثل RBE4، GP8/3.9، GPNT، RBEC1، TR-BBBS أو rBCEC4 خطوط الخلايا الفئران 88،75، خط خلية b.End3 الماوس 90،75، وPBMEC/C1 – 2 الخنزيري خط خلية 87،75، وخط الخلية البشرية hCMEC/D3 89،75. وتستند النماذج الأخرى على خلايا المنشأ غير الدماغي مثل مدين، داربي الكلى الكلاب (MDCK) أو خطوط الخلايا Caco2 12،75. بين مختلف خطوط الخلايا البطانية الدماغي الإنسان، وhCMEC/D3 تم الاستشهاد على نطاق واسعد وتحسين كنموذج للBBB منذ إنشائها في عام 2005 91،92. مثل الثقافات الأولية، وخطوط الخلايا مزايا وقيود الحاضر. أنها أسهل في التعامل معها من الثقافات الأولية، ولها فترة حياة طويلة، وتتميز بشكل جيد وتسمح استنساخ التجارب بين نطاق واسع. ومع ذلك، يمكن خطوط الخلايا تفقد وظائف الأنسجة محددة، وتفقد التنظيم البيئي والحصول على النمط الظاهري الجزيئية مختلفة تماما من الخلايا في الجسم الحي 75، 89. على وجه الخصوص، الطبقات الوحيدة الناتجة من خطوط الخلايا على أن يخفض ضيق، وانخفاض طير ونقل البيانات الشخصية تظهر التباين 75،89. وبالتالي التجارب على الحيوانات أو دراسات في الخلايا الأولية في كثير من الأحيان ويفضل على الرغم من تعقيدها إضافية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به الدعم المالي لVECT-حورس من فون الفريدة Interministériel (مشروع FUI / MEDUL) وVECT-حورس والمختبر UMR7259 من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR، TIMPAD، VECtoBrain، VEC2Brain، ADHOC والمشاريع التعاونية PREVENTAD) . كما يقر المختبر UMR7259 الدعم المالي من CNRS وإيكس مرسيليا من جامعة.
Materials
| Product | Company | Catalog Number | Comments / expiration term |
| BSA fraction V low endotoxin | PAA | K45-011-500g | 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | - 20 °C |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-054 | - 20 °C |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 61965-026 | 4 °C |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10270-098 | - 20 °C / 1 year |
| T75 flasks | Becton Dickinson Falcon | 353135 | |
| HEPES buffer (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | 4 °C / 1 year |
| Collagene type IV mouse (10 x 1 mg) | Becton Dickinson | 356233 | - 20 °C / 1 month |
| Fibronectin humain plasma (5 mg) | Becton Dickinson | 356008 | - 20 °C / 1 month |
| Vannas Spring Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Forceps Dumont #5/45 (11 cm) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Graefe Forceps, tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg) | Roche Diagnostics | 05 401 054 001 | – 20 °C / 3 months |
| DNase I (100 mg / 569 KU / mg) | Sigma Aldrich | DN25-100 mg | - 20 °C / 1 year |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Invitrogen | 15710-049 | 4 °C / 1 year |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 31331-028 | 4 °C |
| Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL) | Clinisciences | BT-214-100 | - 20 °C / 1 year |
| bFGF (10 µg) | Invitrogen | 13256-029 | - 20 °C / 6 months |
| Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I | Sigma Aldrich | H3149-100KU | 4 °C / 1 year |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833-10 mg | - 20 °C / 6 months |
| ITSX | Invitrogen | 51500-056 | 4 °C / 1 year |
| Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates | Millipore | PIRP15R48 | Porosity: 1 µm Surface: 1,1 cm2 |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1 g | - 20 °C / 1 year |
| Mouse anti-CD31 / PECAM | Chemicon | MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Rabbit anti-Von Willebrand | Chemicon | AB7356 | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Mouse anti-Desmine | Chemicon | MAB3430 | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Mouse anti-Vimentine | Invitrogen, Zymed | 08-0052 clone V9, (58 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
| Mouse anti-Claudin-5 | Invitrogen, Zymed | 35-2500, (500 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Rabbit anti-ZO-1 | Invitrogen, Zymed | 61-7300 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Rabbit anti-Occludine | Invitrogen, Zymed | 71-1500 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
| Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies | Invitrogen | 1/800 | |
| Lucifer yellow CH, dilithium salt | Sigma Aldrich | L0259 | - 20 °C |
| TNF-a Human | PeproTech | 300-01A | - 20 °C |
| Rat MCP-1 ELISA Kit | PeproTech | 900-K59 | 4 °C / – 20 °C |
| Mouse anti-P-glycoprotein | Covance, Eurogentec | SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) | 1/400 – fixation PFA 4% 1/200 (western blot) |
| Rabbit anti-GLT-1 | Abcam | ab41621 | 1/1000 (western blot) |
| Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702 | 4 °C |
| Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich | V4629 | 4 °C |
| Cyclosporine A | Sigma Aldrich | 30024 | 4 °C |
| Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat | American Diagnostica | 3501 (100 µg/mL) | 1/5 – fixation PFA 4% |
| Mouse anti-LDLR | R&D systems | AF2255 (200 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
| Rat transferrin-Cy3 | Gentaur | JOR160050 | 4 °C |
| DiILDL | Invitrogen | L-3482 | 4 °C |
References
- Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
- Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
- Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
- Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
- Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
- Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
- Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
- Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
- Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
- Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
- Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
- Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
- Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
- Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
- Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
- Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
- Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
- Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
- Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
- Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
- Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
- Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
- Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
- Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
- Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
- Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
- Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
- Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
- Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
- Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
- Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to ‘open’ the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
- Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
- Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
- Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
- Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
- Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
- Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
- Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
- Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
- Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
- Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
- Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
- Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
- Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
- Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
- Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
- Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
- Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
- Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
- Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
- Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
- Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
- Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
- Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
- Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
- Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
- Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
- Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
- Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
- Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
- Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
- Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
- Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
- Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
- Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
- Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
- Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
- Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
- Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
- Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
- Stanness, K. A., et al. A new model of the blood–brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
- Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
- Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
- Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
- Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
- Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
- Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
- Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).
